Недорогих: Недопустимое название — Викисловарь

Преимущества:

• удобная конструкция;
• легкий вес;
• ветрозащита в комплекте.

4. GreenBean StudioVoice E25 USB

Этот прибор относится к профессиональным, обеспечивает естественное, чистое звучание. Модель оснащена специальным креплением, благодаря чему микрофон удобно размещается в руке, не выпадает и не скользит во время выступления.

Преимущества:

• поп-фильтр, чехол, крепление в комплекте;
• подключение по порту USB;
• чистый качественный звук;
• удобное использование.

5. Audio-Technica ATR6250X

Этот удобный микрофон имеет компактные размеры и стильный дизайн. Бюджетное устройство позволяет осуществить качественную запись звука и удобно при работе с видеокамерами и портативными рекордерами. Большой выбор аксессуаров позволяет увеличить функционал прибора.

Преимущества:

• два кабеля (короткий и длинный) в комплекте;
• широкий частотный диапазон;
• высокая чувствительность.

6. Boya BY-BM58

Этот вокальный микрофон можно также применять для фиксации интервью и презентаций. Он подключается к устройствам при помощи кабеля, снабжен поп-фильтром и изоляцией. Алюминиевый корпус обеспечивает защиту от падений с высоты и царапин.

Преимущества:

• крепление и чехол в комплекте;
• удобное использование;
• широкий частотный диапазон.

7. AKG P5S

Модель имеет суперкардиоидную направленность и записывает голос без лишних помех и посторонних звуков. В результате вы получаете естественную передачу голоса, отсутствие синтетических и глухих шумов. Микрофон лучше использовать для домашней студии или звукозаписи в профессиональном помещении.

Преимущества:

• отличное соотношение цены и качества;
• качественный звук без помех;
• приятный дизайн.

8. Shure SV100-A

Бюджетное устройство с кардиоидной направленностью, подходит для записи вокала, интервью и подкастов. Удобно лежит в руке, на корпусе есть кнопка включения. Модель оптимальна для начинающих исполнителей.

Преимущества:

• легкий вес;
• практичное использование.

Среди бюджетных моделей микрофонов можно действительно найти что-то стоящее. Главное, знать, что покупать. Присмотритесь к этим моделям, возможно, одна из них вам подойдет.

дешёвые цены на частные мини-гостиницы в СПб

При планировании отпуска в другом городе важно побеспокоиться о выборе места проживания. И в данном случае предпочтение стоит отдавать местам, которые предоставляют высококлассный сервис, а одновременно с тем, их услуги имеют дешёвую стоимость. К числу таких частных мини отелей в Питере с уверенностью можно отнести сеть «RA».

Первая из наших частных гостиниц была открыта в 2007 году, но уже сегодня их стало шесть. Однако, все из наших мини отелей в Петербурге расположены в центральной части города. А значит, постояльцы всего лишь за несколько минут пешей прогулки могут добраться не только до ключевых станций метрополитена, но также до достопримечательностей и крупнейших деловых центров.

Это значит, что предложение от компании «RA» заинтересует тех, кто приехал в Северную Столицу отдохнуть или для решения бизнес-вопросов.

Преимущества размещения в нашей сети очевидны:

• Во-первых, в нашем фонде имеется более двух сотен номеров. Это значит, что мы сможем найти свободный номер для вас в частном мини-отеле в Санкт-Петербурге даже в том случае, если вы решите забронировать номер не заблаговременно, а непосредственно в день заезда (особенно удобно для спонтанного уикенда в северной столице).
• Во-вторых, все наши заведения располагаются в центральной части СПб, но в разных микрорайонах. А значит, каждый из гостей сможет выбрать номер в той мини гостинице в Санкт-Петербурге, местоположение которой является наиболее подходящим. Так, допустим, если вы приезжаете в город на поезде на сутки, то предпочтительнее остановиться в хостеле рядом с Московским вокзалом . А тем, кто хочет посвятить максимум времени на знакомство с достопримечательностями, по душе придутся наши частные мини гостиницы Питера, которые находятся на Невском проспекте.
• В-третьих, мы стараемся сделать всё возможное, чтобы обеспечить комфорт для наших гостей. Для этого мы постоянно разрабатываем интересные акции. К примеру, специальное предложения от нашей сети мини-отелей для новобрачных.

И, что немаловажно, цены на бронирование номеров в наших заведениях вполне доступны!

Цена на проживание вас приятно удивит!

В нашей сети мини отелей в Санкт-Петербурге низкие цены на размещение, но при этом мы гарантируем, что каждый из гостей останется доволен остановкой у нас. Связано это с тем, что в СПб в мини отелях «RA»:

• Установлена современная мебель и новая сантехника.
• Имеется доступ к сети Wi-Fi.
• Организован вкусный континентальный завтрак.

Чтобы уточнить цену на аренду номера в нашем недорогом мини-отеле в Петербурге, вы можете ознакомиться с прайс-листом. А заказать или забронировать номер в мини гостинице в СПб можно, связавшись с нашими менеджерами по телефону, электронной почте или через online консультанта на сайте!

ТОП-5 недорогих поддержанных иномарок для девушек

Важным критерием поиска при выборе автомобиля для девушки остаются компактность кузова, маневренность, экономичность и красивый внешний вид.

Автор: Николай Авдеенко, редактор

15 августа 2021

Mazda 3 II (BL) Рестайлинг — автомобиль который часто выбирают за его привлекательный внешний вид. Благодаря небольшим габаритам им легко управлять в городских условиях, а большая моторная линейка позволит комфортно чувствовать себя на трассе. В автомобиль устанавливают двигатели 1,6 литра на 105 сил, 2,0 литра на 150 сил, 2,3 литра на 260 сил. Стоит отметить, что имеются варианты как с «механикой», так и с «автоматом».

Nissan Juke I — городской экономичный кроссовер, со множеством опций. Автомобиль отличается большим дорожным просветом в 180 мм. Это позволяет ему парковаться и ездить в менее доступных местах. Под капотом модели находится 1,6-литровый мотор мощностью 117 лошадиных сил, пару которому может составлять механическая и автоматическая коробка передач.

Kia Picanto III является идеальным автомобилем, который подходит для женщин. Модель отлично себя чувствует в городском потоке, при этом потребляя совсем немного топлива. Здесь устанавливается моторы 1,0 MPI на 67 л.с. и 1,2 MPI на 84 л.с., работающие в паре с «автоматом».

Opel Corsa D Рестайлинг I отлично подойдёт для женщин. Хорошая динамика и умение хорошо держать дорогу, являются главными плюсами данной модели. Чаще всего на дорогах встречаются авто с 1,0-литровым мотором на 65 лошадиных сил, 1,2 литра на 85 сил, и 1,4 на 100 сил. Коробка может быть механической и автоматической.

Последним в списке стоит Ford Fiesta Mk6. Модель отличается хорошей шумоизоляцией, небольшим расходом топлива и объёмным багажником. Поддержанные версии чаще всего имеют мотор на 1,2 литра и 82 силы, а также 1,4 литра 96 сил. Коробка может быть автоматической и механической.

Более подробная информация представлена на портале «Тарантас Ньюс».

Рост цен на медную фольгу заметно поднимет стоимость недорогих материнских плат

Тайваньские источники время от времени упоминают о новых негативных факторах, способных усугубить и без того сложную ситуацию в отрасли по производству электронных компонентов. Рост цен на медную фольгу, которая активно применяется при производстве текстолита (основа любой печатной платы), в большей степени почувствуют на себе покупатели недорогих материнских плат, а вот в верхнем ценовом сегменте этот фактор просто утонет в более заметном влиянии других.

Источник изображения: LCY Technology

Публикация ресурса DigiTimes на тему роста цен на медную фольгу и плакированный медью ламинат, из которого делают печатные платы электронных устройств, заставила представителей сайта Tom’s Hardware попытаться определить, как этот фактор повлияет на стоимость материнских плат и видеокарт — изделий, максимально использующих медную фольгу и текстолит. В случае с видеокартами цены и так высоки из-за спроса со стороны участников криптовалютного рынка, и на нынешних уровнях влияния со стороны цен на медную фольгу они не почувствуют.

Отчасти подобное утверждение справедливо и в отношении дорогих моделей материнских плат. В структуре их себестоимости цена активных электронных компонентов существенно перевешивает долю пассивных элементов и текстолита. С четвёртого квартала 2020 года стоимость медной фольги выросла на 35 %. Предположим, если средняя материнская плата с восьмислойным текстолитом использует 184 грамма меди, то сама стоимость этого материала с декабря прошлого года выросла с $1,42 до $1,70, что не так уж много. Другое дело, что к этой сумме нужно добавить накладные расходы, и тогда в форме медной фольги доля этого материала в себестоимости материнской платы уже может возрасти до $54. Словом, даже если стоимость фольги увеличилась с конца прошлого года на 10 %, то в ценовом сегменте от $100 до $200 результирующее повышение цены материнской платы будет заметным для целевой покупательской аудитории.

Медь в условиях электрификации транспорта, перехода на «зелёную» энергетику и распространения сетей связи 5G будет востребованным материалом, и цены продолжат расти. Адекватной альтернативы меди в качестве проводника в этом случае нет, поэтому к росту цен на электронику придётся привыкать.

Если вы заметили ошибку — выделите ее мышью и нажмите CTRL+ENTER.

State: Нет простых, недорогих или универсальных решений для борьбы с береговой эрозией | Новости, Спорт, Работа

Прошлой весной на пляже Кухио в Вайкики на острове Оаху был проведен проект восстановления пляжа. ФОТО ДЛНР.

ГОНОЛУЛУ — Варианты, доступные управляющим землей и владельцам прибрежной собственности, сталкивающейся с серьезной эрозией пляжа, ограничены, дороги и вряд ли обеспечат постоянные исправления.Это один из выводов недавней презентации Совету по земельным и природным ресурсам.

Шелли Хабел, прибрежный геолог из Программы морских грантов Гавайского университета, прикомандирована к Управлению охраны природы и прибрежных земель DLNR (OCCL). Ее сообщение членам земельного совета указывало на трудности, связанные с борьбой с эрозией пляжей.

«Проблемы нарастают до такой степени, что DLNR необходимо будет прояснить свои цели и соответствующим образом сосредоточить свои усилия на эффективном управлении прибрежными ресурсами», — сказал Хабель.

Она подробно описала текущее состояние эрозии пляжей на Гавайях, цитируя правительственные и академические отчеты, которые указывают на то, что 70 процентов пляжей на Мауи, Кауаи и Оаху подвергаются хронической эрозии. К 2012 году более 13 миль пляжа полностью исчезли из-за эрозии и строительства дамбы.

Причины варьируются от пляжа к пляжу и включают долгосрочные изменения уровня моря, добычу песка, дамбы, ландшафтный дизайн, а также естественные и сезонные изменения в движении песка.

Habel сообщил, что повышение уровня моря и сезонная эрозия не поддаются контролю, а повышение уровня моря на один фут может означать, что береговая линия перемещается вглубь суши на 50–100 футов.

Эрозия пляжей — глобальная проблема, и ее можно решить тремя основными способами, ни один из которых не является простым или недорогим и не требует компромиссов.

Укрепление береговой линии: исторический ответ с использованием твердых конструкций. Это привело к повсеместному сносу пляжей и нанесению ударов по соседним небронированным объектам.

Отступление береговой линии: смещение развития вглубь суши. Это противоречиво во всем мире, и на сегодняшний день нет эффективных примеров.

Проекты восстановления прибрежных районов: варианты краткосрочного и среднесрочного обслуживания, требующие периодической работы для сохранения выгод. Требуют тщательного проектирования и реализации, чтобы минимизировать потенциальное воздействие на окружающую среду.

Проекты по восстановлению и укреплению береговой линии были частью мер OCCL по борьбе с эрозией. У обоих есть недостатки.

Хабель отметил растущую озабоченность людей по поводу предстоящих проектов восстановления и укрепления береговой линии, когда это необходимо для уменьшения угроз для здоровья, безопасности и благополучия населения.

OCCL перегружен более чем 70 несоответствующими разрешениями на чрезвычайные ситуации для проектов временного укрепления, многие на Северном берегу Оаху.

Хабель заключил: «Мы принимаем участие в различных мероприятиях по защите наших пляжей, а также помогаем в развитии прибрежных территорий.Это становится все труднее и труднее, поскольку наши прибрежные опасности усиливаются, что требует от нас использования всех доступных инструментов, чтобы обеспечить управление прибрежными зонами наилучшим образом ».

Обнаружение SARS-CoV-2 с использованием изотермической амплификации и быстрого и недорогого протокола инактивации и очистки образцов

Значимость

В этой работе описывается оптимизация конвейера подготовки и обнаружения образцов для быстрого диагностического теста SARS-CoV-2 и не требует специального оборудования.Этот конвейер включает инактивацию вирусов, делающую образцы более безопасными для работы, с последующей чувствительной 30-минутной изотермической реакцией обнаружения с отображением от красного к желтому на основе цвета. Чувствительность можно дополнительно улучшить, используя простой и недорогой протокол очистки. Этот конвейер может помочь решить проблему нехватки возможностей тестирования и может работать в различных условиях.

Abstract

Текущая пандемия тяжелого острого респираторного синдрома, вызванная коронавирусом 2 (SARS-CoV-2), оказала огромное влияние на общество во всем мире, угрожая жизни и средствам к существованию многих людей.Последствия будут продолжать расти и ухудшаться, если экономика начнет открываться без надлежащих мер предосторожности, включая расширенные диагностические возможности. Чтобы удовлетворить эту потребность в расширении тестирования, мы разработали чувствительный анализ изотермической амплификации, опосредованной петлей обратной транскрипции (RT-LAMP), совместимый с текущими реагентами, который использует колориметрическое считывание всего за 30 минут. Протокол быстрой инактивации, способный инактивировать вирионы, а также эндогенные нуклеазы, был оптимизирован для повышения чувствительности и стабильности образца.Этот протокол в сочетании с анализом RT-LAMP имеет чувствительность не менее 50 копий вирусной РНК на микролитр в образце. Для дальнейшего повышения чувствительности был разработан протокол очистки, совместимый с этим методом инактивации. Протокол инактивации и очистки в сочетании с анализом RT-LAMP обеспечивает чувствительность по крайней мере до 1 копии вирусной РНК на микролитр в образце. Этот простой конвейер инактивации и очистки является недорогим, совместим с другими платформами для обнаружения РНК, расположенными ниже по цепочке, и использует легко доступные реагенты.Это должно повысить доступность тестирования SARS-CoV-2, а также расширить настройки, в которых это тестирование может быть выполнено.

Нынешняя пандемия коронавируса 2 (SARS-CoV-2) тяжелого острого респираторного синдрома оказала и будет продолжать оказывать огромное влияние на общество во всем мире, угрожая жизни и средствам к существованию многих людей. По мере распространения болезни потребность в инструментах быстрой диагностики по месту оказания медицинской помощи стала огромной. В настоящее время прилагаются большие усилия для разработки анализов, которые можно использовать в различных условиях (1).Идеальный анализ не требует специального оборудования и дает быстрый, легко читаемый результат. С этой целью мы разработали анализ, основанный на методе изотермической амплификации, опосредованной обратной транскрипцией (RT-LAMP). Чтобы повысить чувствительность, мы также разработали метод подготовки образцов, который можно использовать в качестве первого шага для многих различных типов последующих анализов. Протокол простой, недорогой и быстрый, и в нем используются реагенты, которые можно легко приготовить в больших количествах.

LAMP — это метод изотермической репликации ДНК, который использует в ускоренном формате шесть ДНК-олигонуклеотидов, которые гибридизуются с восемью различными участками целевой молекулы (2, 3). При использовании замещающей цепи полимеразы и петель, образующихся во время этой реакции, происходит быстрая реакция амплификации при правильном связывании олигонуклеотидов с желаемой мишенью. Такие реакции генерируют микрограммы ДНК за очень короткий период времени при одной температуре реакции. Кроме того, хотя замещающая цепь полимераза обладает активностью обратной транскриптазы, обратная транскриптаза может быть включена для повышения чувствительности реакции при обнаружении РНК-мишени (RT-LAMP), такой как РНК SARS-CoV-2.Анализы LAMP имеют различные показания из-за большого количества генерируемой ДНК, включая флуоресценцию с использованием интеркалирующего красителя ДНК, мутность или падение pH, если реакция минимально забуферена (1, 4, 5). Это изменение pH, достаточное для того, чтобы индикаторный краситель pH заметно изменил цвет, является оптимальным методом диагностики на основе LAMP в месте оказания медицинской помощи.

Мы разработали и протестировали 11 наборов праймеров для анализа RT-LAMP и использовали реактивы LAMP от New England Biolabs (NEB) для колориметрического считывания.Они были протестированы относительно других праймеров, недавно опубликованных NEB. Оптимальный набор праймеров, направленных на неконсервативную область гена SARS-CoV-2 Orf1a, был идентифицирован как особо чувствительный, но не подверженный фоновым сигналам. Помимо разработки надежного набора праймеров RT-LAMP, мы также стремились оптимизировать подготовку образцов таким образом, чтобы максимизировать чувствительность и сделать образцы стабильными и безопасными для персонала, проводящего тестирование. Мы исследовали толерантность реакции RT-LAMP к детергентам и хаотропным солям, которые могут способствовать лизису вирионов и очистке геномов вирусной РНК и информационной РНК.Кроме того, мы оптимизировали очень простой и быстрый протокол, основанный на методе HUDSON (6), для инактивации вирионов, а также эндогенных РНКаз, скорректировав состав, чтобы обеспечить его совместимость с показаниями на основе pH. Эта последняя модификация имела преимущество снижения температуры, при которой инактивируются РНКазы. Эти методы позволяют добавить в реакцию не менее 5 мкл образца (мазки из носоглотки [NP] в физиологическом растворе / фосфатно-солевом буфере [PBS] или чистая слюна), чтобы довести чувствительность до 10-50 копий РНК на микролитр образца.Мы также разработали простой и быстрый процесс, с помощью которого вирусную РНК можно очистить и сконцентрировать из 0,5 мл среды для сбора, так что при использовании с нашим набором праймеров Orf1a предел обнаружения падает как минимум до 2 копий РНК на микролитр. В отличие от схем очистки, используемых для текущего одобренного Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) теста на основе qRT-PCR, эта очистка не требует коммерческого набора. Он связывает нуклеиновые кислоты с диоксидом кремния в форме суспензии, известной как «стеклянное молоко» (7), которая легко доступна в промышленных количествах по невысокой цене.Общая стоимость инактивации и очистки составляет приблизительно 0,07 доллара США за образец. Ранняя клиническая валидация этих протоколов с образцами пациентов, состоящими из мазков в физиологическом растворе, показала, что одна инактивация увеличивает чувствительность до> 95% образцов со значениями Ct qRT-PCR <30 и общей чувствительностью 85% (8). Стеклянная очистка молока увеличивает эту чувствительность как минимум в 10 раз. Кроме того, было обнаружено, что специфичность составляет 100%, без ложноположительных результатов (8).

Результаты

Чувствительность анализов HMS и NEB RT-LAMP.

Мы разработали и протестировали 11 наборов праймеров LAMP для геномов SARS-CoV-2 с использованием V5 (https://primerexplorer.jp/e/), за исключением праймеров петель для Orf1a. PrimerExplorer не смог найти набор для этой области генома, поэтому петлевые праймеры для Orf1a-Гарвардской медицинской школы (Orf1a-HMS; SI, приложение , таблица S1) были сконструированы вручную. Orf1a-HMS находится в области SARS-CoV-2, которая не сохраняется ни с SARS, ни с изолятом SARS-подобного летучих мышей коронавируса Rs4084, двумя близкородственными коронавирусами (рис.1 А ). Несмотря на отсутствие консервативности среди коронавирусов, данные секвенирования клинических изолятов SARS-CoV-2 со всего мира, полученные через Nextstrain (9), не показывают, что эта область-мишень мутирует быстрее, чем остальная часть генома (рис. 1 B и C ). Первоначальные тесты показали, что праймеры Orf1a-HMS превосходят другие наши наборы праймеров. Затем мы создали Orf1a-Harvard Medical School Enhanced (Orf1a-HMSe, SI, приложение , таблица S1) путем модификации прямого внутреннего праймера (FIP) и обратного внутреннего праймера (BIP), чтобы включить линкер «TTTT» между F1c и F2. области, поскольку сообщалось, что это еще больше улучшает реакцию (10).Orf1a-HMS и Orf1a-HMSe были протестированы с использованием набора NEB WarmStart LAMP Kit (NEB E1700) со считыванием данных на основе флуоресценции в реальном времени (рис. 2). В этой схеме реакции каждый цикл составляет 30 с при 65 ° C. В идеале положительный результат будет считываться через 30 минут или 60-й цикл, временную точку, используемую Zhang et al. (1). Мы использовали РНК положительного контроля от Twist Bioscience (Sku 102019) в реакциях объемом 10 мкл в трех экземплярах, включая 0, 100, 200 или 300 копий вирусной РНК на реакцию. Как видно, оба набора праймеров способны обнаруживать вирусную РНК с низким числом копий.Для дальнейшей оценки чувствительности мы провели повторные реакции с использованием того же считывания на основе флуоресценции с Orf1a-HMS, Orf1a-HMSe и NEB Orf1a-C ( SI, приложение , рис. S1). Для каждого мы провели 48 реакций по 10 мкл с 200 копиями вирусной РНК в каждой и 48 реакций по 10 мкл без добавления вирусной РНК. Как можно видеть, как Orf1a-HMS, так и Orf1a-HMSe показали высокую амплификацию в 45 и 47 из 48 реакций с 200 копиями РНК, соответственно. Кроме того, ни в одной из реакций без вирусной РНК не наблюдалось амплификации через 60 мин.NEB Orf1a-C не работал так же хорошо, так как время до амплификации в реакциях с 200 копиями РНК сильно варьировало, и многие из них не амплифицировались до или после 30-минутной точки. Более того, две реакции без вирусной РНК показали амплификацию, но мы не можем исключить возможность того, что эти реакции, какими бы чувствительными они ни были, были загрязнены. Эти данные предполагают, что Orf1a-HMS и Orf1a-HMSe являются более надежными наборами праймеров для этого анализа.

Консервация последовательности целевой области Orf1a-HMS между родственными коронавирусами и внутри изолятов SARS-CoV-2.( A ) Выравнивание (blastn, мегабласт) SARS, изолята Rs4084 коронавируса типа Bat SARS и последовательности, обнаруженной с помощью Orf1a-HMS / Orf1a-HMSe. ( B и C ) Измерение секвенированных нуклеотидных мутаций в подмножестве глобальных данных, предоставленных Nextstrain (энтропия нуклеотидов), адаптированных из визуального интерфейса Nextstrain. Указана целевая область Orf1a-HMS / Orf1a-HMSe (от 2245 до 2441). ( B ) Просмотр всего генома. ( C ) Крупный план целевой области.

Тест начальной чувствительности выбранных наборов праймеров RT-LAMP. Флуоресцентные реакции RT-LAMP проходят в течение 120 30-секундных циклов при 65 ° C: 0 (синий), 100 (зеленый), 200 (красный) или 300 (фиолетовый) контрольных копий РНК, включенных в реакцию ( n = 4) . Были выполнены анализы ( A ) Orf1a-HMS и ( B ) Orf1a-HMSe. RFU, относительные единицы флуоресценции.

Допуск моющих средств.

Чтобы потенциально улучшить чувствительность реакции RT-LAMP при использовании образцов пациентов, мы предположили, что увеличение количества детергента в реакции может помочь лизировать вирионы, делая их геномную РНК более доступной для обратной транскрипции и амплификации.Используя Orf1a-HMS и те же флуоресцентные реакции объемом 10 мкл, как описано выше, мы провели реакции с 500 копиями вирусной РНК и различными количествами добавленного Tween20 или TritonX100. Реакция вполне устойчива к добавленным детергентам, и можно было наблюдать устойчивую амплификацию, по крайней мере, до 1,5% Tween20 и 1% TritonX100 (рис. 3). Амплификация все еще могла быть обнаружена для обоих детергентов до 3%, но реакции, по-видимому, выходили на плато при более низком уровне флуоресценции, когда уровни детергента увеличивались.

Оценка толерантности к моющим средствам RT-LAMP. Флуоресцентные реакции RT-LAMP проходят в течение 120 30-секундных циклов при 65 ° C. Все реакции содержат 500 копий контрольной РНК, набор праймеров Orf1a-HMS и от 0 до 3% добавленных ( A ) Tween20 или ( B ) TritonX100, как указано.

Сравнение чувствительности праймеров NEB и HMS к хаотропным солям с использованием колориметрических данных.

Чтобы оптимизировать протоколы, в которых используются хаотропные соли во время очистки, мы проверили толерантность колориметрических реакций RT-LAMP к GuSCN и NaI, двум таким хаотропным солям, обнаружив, что реакция толерантна к любой из них до 50 мМ ( SI Приложение , рис.S2) (7, 11). Хотя наш окончательный рекомендуемый протокол (ниже) не использует GuSCN (отчасти из-за проблем с производственными масштабами, а также из-за опасности смешивания GuSCN с отбеливателем), мы разработали протокол, который его использует, для ситуаций, когда GuSCN является хаотропным. агент в использовании. Мы протестировали влияние 50 мМ GuSCN на чувствительность анализа RT-LAMP с различными наборами праймеров. Это также служило для прямого сравнения чувствительности Orf1a-HMS, Orf1a-HMSe, NEB Gene N-A и NEB Orf1a-C в реакциях RT-LAMP.

NEB Orf1a-C показал худшие результаты с GuSCN или без него (рис. 4 A ), обнаружив 2/40 при 100 копиях вирусной РНК и 5/40 при 200 копиях вирусной РНК. Этот результат был неожиданным, поэтому мы снова провели эксперимент, переработав все реагенты, включая смеси праймеров, и включив четыре реакции Orf1a-HMSe с 200 копиями вирусной РНК в качестве контроля планшета ( SI, приложение , рис. S3). Результаты были такими же: NEB Orf1a-C обнаруживал 1/40 при 100 копиях вирусной РНК и 1/40 или 2/40 при 200 копиях вирусной РНК (одна из реакций на 200 копий РНК стала заметно оранжевой, но не желтой). .NEB Gene NA показал лучшие результаты, обнаруживая от 11/40 до 13/40 с использованием 100 копий вирусной РНК (в зависимости от того, считаются ли пограничные оранжевые реакции положительными) и от 22/40 до 29/40 с 200 копиями вирусной РНК (рис.4 ). B ). Orf1a-HMS и Orf1a-HMSe были гораздо более чувствительными. При 100 копиях вирусной РНК Orf1a-HMS и Orf1a-HMSe детектировали 26/40 и 31/40 соответственно (фиг. 4 C и D ). При 200 копиях вирусной РНК Orf1a-HMS и Orf1a-HMSe обнаруживали 36/40 и 39/40 соответственно.Кроме того, все положительные реакции были полностью желтыми, без неоднозначных оранжевых реакций. Ни одна из реакций без вирусной РНК не привела к положительной реакции ни в одном из протестированных анализов (рис. 4). Также не было разницы в чувствительности между реакциями, которые содержали 50 мМ GuSCN, и реакциями, которые не содержали, при использовании праймеров Orf1a-HMSe.

Оценка влияния GuSCN на чувствительность колориметрических анализов RT-LAMP. Колориметрические реакции RT-LAMP проводят с отмеченным количеством копий контрольной РНК (0, 100 или 200).Реакции проводили с 50 мМ GuSCN (+) или без GuSCN (-), как указано. ( A ) Набор праймеров NEB Orf1a-C. ( B ) Набор праймеров NEB Gene N-A. ( C ) Набор праймеров Orf1a-HMS. ( D ) Набор праймеров Orf1a-HMSe. Звездочкой * обозначены реакции, которые были заметно оранжевыми, но не полностью желтыми.

Цели для оптимизированного протокола быстрой инактивации / стабилизации и очистки.

Текущие методы сбора образцов, используемые для тестирования SARS-CoV-2, требуют помещения тампонов в 2–3 мл коммерческой среды для сбора, такой как среда для сбора вирусов Quest Diagnostics (VCM) (7).Этот метод представляет собой серьезную проблему для обнаружения на основе RT-LAMP, так как очень мало (не более 1 мкл) можно использовать в реакции объемом 25 мкл из-за присутствия красителей и буферов в VCM, которые могут препятствовать визуализации сдвиг pH в положительной реакции (8). Другие среды для сбора, такие как 0,9% физиологический раствор, обладают меньшим ингибирующим действием. Наконец, важно отметить, что обработка образцов сопряжена с риском, поскольку такие образцы могут содержать инфекционный вирус. Таким образом, мы решили разработать серию протоколов, которая включает быструю инактивацию вирионов в различных типах образцов при сохранении инактивированной РНКазы.Кроме того, наша цель состояла в том, чтобы этот протокол повысил чувствительность, при этом он был совместим как с прямым добавлением к реакциям RT-LAMP, так и с очисткой на основе NaI (схематично на рис. 5).

Простая и быстрая схема дезактивации и очистки образцов. ( A ) Схема, изображающая инактивацию образца и прямое тестирование RT-LAMP. ( B ) Схема процедуры очистки и тестирования постинактивации мазков. ( C ) Схема процедуры очистки и тестирования постинактивации образцов слюны.

Протокол инактивации.

Чтобы быстро инактивировать / лизировать вирионы, одновременно защищая их РНК от эндогенных РНКаз, мы использовали простой протокол, основанный на протоколе HUDSON (6), с использованием стабильного при хранении восстанавливающего агента, Трис (2-карбоксиэтил) фосфина ( TCEP), хелатор двухвалентных катионов этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA) и кратковременное нагревание при 95 ° C. (Тем не менее, более низкие температуры могут быть достаточными; SI Приложение , рис. S6.) В этом протоколе 1/100 объема образца смеси 100 × TCEP / EDTA (реагент инактивации) добавляется к образцу, который затем смешивается и нагревали при 95 ° C в течение 5 мин.Этот протокол быстро денатурирует белки, используя TCEP для уменьшения любых дисульфидных мостиков. Любые двухвалентные катионы, необходимые для активности РНКазы, высвобождаются из денатурированных белков и секвестрируются ЭДТА, делая любые ренатурированные РНКазы инертными. Мы обнаружили, что этого достаточно, чтобы инактивировать активность РНКазы; Дополнительным преимуществом является то, что восстановители снижают вязкость слюны и слизи (12). Полученный инактивированный образец полностью совместим с прямым добавлением к реакции RT-LAMP, при этом допускается не менее 5 мкл.Этого протокола должно быть достаточно для инактивации любых вирионов SARS-CoV-2 в образце, что делает образец гораздо более безопасным для последующей обработки и транспортировки (13, 14). Ранее разработанные методы лизиса РНК-вирусов используют стадию лизиса при 95 ° C, а ближневосточный респираторный синдром-CoV очень чувствителен даже к 1 минуте при 65 ° C (6, 14).

Используя этот протокол, в реакцию можно добавить не менее 5 мкл инактивированного образца, включая мазки в физиологическом растворе и 1 × PBS, а также чистую слюну (без какого-либо другого препарата), что обеспечивает надежное обнаружение при 50 копиях РНК. на микролитр в исходной пробе (рис.6). Этот протокол также может быть дополнен только этим реагентом для инактивации и источником кипящей воды, что обеспечивает быструю инактивацию и стабилизацию образца в самых разных условиях. В результате инактивации образец остается со слабощелочным pH с 2,5 мМ TCEP и 1 мМ EDTA, поэтому такие инактивированные образцы, вероятно, будут совместимы с различными тестами на обнаружение нуклеиновых кислот, а не только с анализом RT-LAMP. Мы также обнаружили, что дитиотреитол (DTT) может работать вместо TCEP с незначительным изменением используемого гидроксида натрия (NaOH), поскольку DTT не такой кислый, как TCEP.Однако DTT гораздо менее стабилен, поэтому мы выбрали TCEP в качестве оптимального стабильного при хранении реагента.

с набором праймеров Orf1a-HMSe после инактивации образца. Прямое обнаружение в восстановленных мазках из горла и носа в ( A ) физиологическом растворе, ( B ) 1 × PBS или ( C ) восстановленной слюне. Копии контрольной РНК добавляли в образцы во время инактивации (указана концентрация). Образцы отрицательного контроля (-) не содержали добавленной РНК. После инактивации 5 мкл образца добавляли в колориметрическую реакцию RT-LAMP с праймерами Orf1a-HMSe.Положительные контрольные реакции (+) содержали дополнительно 1000 контрольных копий РНК, добавленных непосредственно в реакцию.

Протокол очистки.

Чтобы еще больше повысить чувствительность этого теста, сделав его недорогим, доступным и легко масштабируемым, мы стремились оптимизировать протокол очистки, позволяющий сконцентрировать вирусную РНК из большего объема образца в одну реакцию. Таким образом, мы протестировали очень недорогую и высокодоступную суспензию частиц диоксида кремния, известную как «стеклянное молоко» (7).Эта суспензия получается путем очистки мелких частиц диоксида кремния и их суспендирования в равном объеме воды. Одна лаборатория может подготовить достаточно для десятков миллионов очисток в день по цене менее 45 долларов за 1 миллион очисток. Эта суспензия является предшественником обычно используемых сегодня наборов для очистки колонок на основе диоксида кремния. Как и в случае с этими колонками, нуклеиновые кислоты будут связываться с диоксидом кремния в присутствии хаотропных солей, таких как GuSCN или NaI (7, 11).

Наш предпочтительный протокол очистки РНК основан на NaI, который часто использовался в качестве хаотропной соли выбора для очистки ДНК от агарозных гелей с использованием стеклянного молока (7).В таких протоколах три объема 6 М NaI добавляли к срезам геля, чтобы расплавить гель и связать ДНК со стеклянным молоком. Мы обнаружили, что конечной концентрации 2 М NaI было достаточно для концентрирования геномов контрольной РНК с помощью стеклянного молока. Это довольно удобно, поскольку использование меньшего объема связующего позволяет обрабатывать больший объем образца.

Очистка мазков в физиологическом растворе / PBS.

Для образцов, которые состоят из тампонов в физиологическом растворе или 1 × PBS, к образцу добавляют 1/2 объема связующего раствора на основе NaI (6 M NaI, 2% TritonX100, 10 мМ HCl) и 5 ​​мкл стеклянного молока. после описанного ранее этапа тепловой инактивации (рис.5 В ). Затем образец смешивают и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 минут, чтобы позволить РНК связать (образцы переворачивают каждые 1–2 минуты, чтобы диоксид кремния оставался в суспензии). Затем образцы подвергают импульсному центрифугированию в настольной микроцентрифуге, такой как VWR Galaxy Mini (или в более крупной настольной центрифуге при 2000 × g), для осаждения кремнезема, и супернатант сливают. Выполняется однократная промывка 80% этанолом с последним отжимом и использованием микропипетки или пипетки для переноса с тонким наконечником для удаления последних следов 80% этанола.Осадок частиц диоксида кремния со связанной РНК сушат либо при комнатной температуре, либо при 65 ° C. После сушки можно напрямую добавить 25 мкл LAMP-реакционной смеси и ресуспендировать диоксид кремния, после чего РНК элюируется в реакцию. Затем реакция может быть запущена напрямую, или образец может быть перенесен в другой реакционный сосуд с включенными частицами кремнезема. По мере протекания реакции частицы диоксида кремния опускаются на дно трубки и остаются инертными. При очистке мазков в физиологическом растворе или 1 × PBS это обеспечивает высокую чувствительность, по крайней мере, до одного генома на микролитр в исходном образце (рис.7 A и B ).

Тест чувствительности с набором праймеров Orf1a-HMSe после очистки образца. Прямое обнаружение в восстановленных мазках из горла и носа в ( A ) физиологическом растворе, ( B ) 1 × PBS или ( C ) восстановленной слюне. Копии контрольной РНК добавляли в образцы во время инактивации (указана концентрация). Образцы отрицательного контроля (-) не содержали добавленной РНК. После инактивации образцы очищали с использованием стеклянного молока с помощью центрифуги и непосредственно добавляли колориметрическую реакцию RT-LAMP с праймерами Orf1a-HMSe.Положительные контрольные реакции (+) содержали дополнительно 1000 контрольных копий РНК, добавленных непосредственно в реакцию. Как указано, реакции проводили в течение от 30 до 40 минут при 65 ° C.

Мы обнаружили, что описанный выше протокол может быть легко адаптирован к ситуациям, в которых центрифуга недоступна. После связывания РНК с диоксидом кремния образцы можно просто оставить в покое от 5 до 10 минут, позволяя большей части диоксида кремния осесть на дно пробирки; затем можно слить супернатант.Для этой процедуры мы включили две промывки 80% этанолом, чтобы гарантировать удаление ингибиторов, давая 2 мин, чтобы кремнезем опустился на дно пробирки между промывками. Мы использовали пипетку для переноса с тонким наконечником, чтобы удалить последнюю промывку перед сушкой гранулы и проведением реакции, как описано выше. Хотя некоторые частицы диоксида кремния теряются, особенно мельчайшие частицы, которые нелегко выпадают из раствора, мы все же смогли достичь чувствительности по крайней мере до 1 копии РНК на микролитр при очистке от 0.5 мл тампонов в физиологическом растворе 1 × PBS ( SI Приложение , рис. S4).

Очистка от слюны.

Мы также стремились разработать протокол очистки вирусной РНК из слюны, поскольку запасы мазков могут стать ограниченными, а сбор слюны не требует помощи медицинского работника, как это делает текущий протокол мазка NP. Мы начали со слюны, инактивированной описанным выше протоколом инактивации (рис. 5 C ). Перед добавлением NaI или стеклянного молока образцы центрифугируются в настольной микроцентрифуге, такой как VWR Galaxy Mini, или другой центрифуге, при 2000 × g в течение 10–15 секунд.На этом этапе флокулянт в этих образцах осаждается, что позволяет вылить очищенный образец в новую пробирку. После завершения этого этапа «предварительной очистки» очистка очищенного супернатанта может продолжаться точно так же, как описано выше для образцов мазков в среде, что позволяет снизить чувствительность по крайней мере до 1 копии РНК на микролитр при запуске с 0,5 мл слюны (рис. 7 С ).

К сожалению, нам не удалось усовершенствовать протокол очистки от слюны, не основанный на использовании небольшой центрифуги, хотя недавние инновации, такие как портативное устройство «paperfuge», которое легко сделать, могут помочь решить эту проблему (15).Мы пытались дать материалу флокулянта осесть под действием силы тяжести в течение 30 минут (в течение которых большая часть его оседает на дно пробирки, но не все) и безуспешно переносили остаток в новую пробирку. Мы продолжим работать над этим и пригласим других сделать это, чтобы сделать протоколы очистки на основе слюны как можно более доступными.

Очистка от коммерческих коллекционных сред.

Мы также оптимизировали протоколы для очистки от часто используемых носителей для сбора, включая Quest Diagnostics VCM и PrimeStore MTM.Вирусная РНК может быть очищена от VCM после тепловой инактивации с помощью TCEP и EDTA, после чего желатин в собирающей среде вылетает из раствора. Образец можно центрифугировать, а очищенный супернатант можно использовать для очистки с добавлением связывающего раствора NaI с добавлением немного большего количества HCl. Образцы в PrimeStore MTM можно обрабатывать так же, как образцы физиологического раствора / PBS, которые уже были инактивированы. Таким образом, можно добавить 1/2 объема реагента, связывающего NaI, и можно будет продолжить очистку.Для обоих образцов наблюдалась сопоставимая чувствительность по сравнению с другими типами образцов, описанными выше ( SI, приложение , рис. S5).

Стабильность РНК после инактивации и на протяжении всей очистки.

Чтобы убедиться, что эндогенные РНКазы полностью инактивированы с помощью этих протоколов, мы инактивировали образцы слюны, а также мазки в физиологическом растворе или 1 × PBS, а затем добавили контрольную вирусную РНК (100 копий на микролитр) для проверки деградации. Инактивированные образцы с этими контрольными РНК инкубировали при 37 ° C в течение 30 минут, что давало возможность любой остаточной РНКазной активности разрушить контрольные РНК.Когда 5 мкл этих образцов были использованы в 25 мкл реакций RT-LAMP с праймерами Orf1a-HMSe, все реакции дали положительный результат (фиг. 8 A ). Мы также инкубировали аналогично инактивированную слюну и смеси 1: 1 слюна / физиологический раствор в течение 24 часов при комнатной температуре перед проведением тех же реакций. И снова все реакции из образцов с контрольными копиями РНК дали положительный результат (рис. 8 A ). Мы также обнаружили, что РНК в высушенном осадке РНК / диоксид кремния достаточно стабильна. После очистки мы инкубировали высушенный осадок РНК / диоксид кремния в течение 48 часов при комнатной температуре перед проведением 25-мкл реакции RT-LAMP с праймерами Orf1a-HMSe.Все реакции из образцов с добавленными копиями контрольной РНК (до двух копий РНК на микролитр) дали положительный результат (фиг. 8 B ). Это указывает на то, что РНКазы полностью инактивированы этим протоколом. Мы также протестировали инактивацию при различных температурах. Инкубация при температуре от 25 ° C до 65 ° C не полностью инактивировала РНКазы ( SI Приложение , рис. S6, A и B ). Однако с использованием нашего реагента для инактивации, который является щелочным, чтобы быть совместимым с колориметрическими показаниями на основе pH, активность РНКазы была отменена при инактивации при 75 ° C.Образцы, инактивированные щелочным инактивирующим реагентом при температуре 75 ° C или выше ( SI Приложение , рис. S6, C и E ). Если к таким инактивированным образцам добавить контрольные РНК и затем инкубировать при 37 ° C в течение 30 минут с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 24 часов, они дали положительный результат ( SI Приложение , рис. S6 C и E ). Однако при использовании реагента для инактивации при нейтральном pH требовалась инактивация при 95 ° C. Это говорит о том, что РНКазы легче инактивировать в щелочном растворе, потенциально сокращая любое окно между вирусным лизисом и инактивацией РНКазы.Активность РНКазы также ингибировалась концентрацией NaI, использованной во время связывания для очистки (2 M) (фиг. 8, C и D ).

Доказательства стабильности РНК от инактивации путем очистки. ( A ) Мазки в физиологическом растворе, мазки в 1 × PBS, слюне или смеси слюны и физиологического раствора 1: 1 инактивировали и добавляли контрольную РНК до 100 копий на микролитр. После инактивации образцы инкубировали в течение 30 минут при 37 ° C в течение 30 минут или 24 часов при комнатной температуре, как указано, перед тем, как 5 мкл добавляли к колориметрической реакционной смеси RT-LAMP с праймерами Orf1a-HMSe.( B ) Тампоны объемом 500 мкл в физиологическом растворе очищали с использованием стеклянного молока на центрифуге. Высушенные гранулы РНК / диоксида кремния оставляли при комнатной температуре на 48 ч перед добавлением колориметрической реакционной смеси RT-LAMP с праймерами Orf1a-HMSe. Образец отрицательного контроля (-) не содержал копий РНК, добавленных к образцу. Положительные контрольные реакции (+) имели 1000 копий РНК, добавленных непосредственно в реакцию. ( C и D ) РНКазная активность тампонов, помещенных непосредственно в растворы NaI (указана концентрация).Реакции RNase Alert инкубируют в течение 30 мин при 37 ° C; ( C ) светлое поле, ( D ) канал флуоресценции 488 нм; флуоресценция указывает на активность РНКазы.

Обсуждение

В этом отчете мы представили доказательства чувствительного анализа RT-LAMP для вируса SARS-CoV-2, который стал еще более чувствительным благодаря быстрой и очень доступной схеме инактивации и очистки. Схема совместима с современными методами сбора, при которых мазки помещаются в большой объем собирающей среды, а также образцы прямой слюны.Эта схема инактивации и очистки, а также анализ RT-LAMP просты и быстры, недороги и не требуют специального оборудования. Реакционные смеси RT-LAMP можно лиофилизировать, при этом смесь остается стабильной в течение многих лет при 4 ° C или недель при комнатной температуре (16, 17). Это устранит барьер холодовой цепи для развертывания в районах с ограниченными ресурсами, где холодная доставка и замороженное хранение могут оказаться невозможными. Такие лиофилизированные реакционные форматы также позволят добавлять увеличенные объемы образцов в каждую реакцию.

Протокол инактивации быстро инактивирует как вирионы (13, 14), так и эндогенные РНКазы (6). Это работает как для стабилизации вирусной РНК перед обнаружением, так и для того, чтобы сделать образцы более безопасными для последующей обработки. Кроме того, этот протокол инактивации должен быть совместим с большинством других анализов обнаружения нуклеиновых кислот, включая используемый в настоящее время тест qRT-PCR, одобренный FDA. Используемый здесь щелочной раствор для инактивации также снижает температуру, необходимую для инактивации, с 95 ° C до 75 ° C ( SI Приложение , рис.S6), что может повысить безопасность работы с образцами.

Частицы диоксида кремния, используемые для очистки, состоят из неочищенного порошка диоксида кремния и могут быть очень быстро получены в огромных количествах. Кроме того, для каждой очистки требуется очень мало (1 л достаточно для 200 000 очисток). Одна лаборатория может легко сделать достаточно для миллионов тестов, что позволяет учреждениям с базовым оборудованием, таким как центрифуги и автоклавы, производить достаточное количество для удовлетворения высокого спроса.Очистку каждого образца тампона можно выполнить за считанные минуты в одной пробирке без центрифуги, используя только два раствора. Множественные очистки могут выполняться параллельно, что позволяет медицинскому персоналу в медицинских учреждениях эффективно проводить очистку. Очищенные образцы можно хранить при комнатной температуре после процедуры очистки стеклянного молока, что позволяет собирать и хранить образцы перед анализом в различных типах анализов.

Эти протоколы могут использоваться вместе в одном конвейере.Образцы пациентов могут быть сначала инактивированы и протестированы непосредственно в анализе RT-LAMP с праймерами Orf1a-HMSe с чувствительностью не менее 50 копий вирусной РНК на микролитр за 30 мин. Образцы, показывающие отрицательные результаты в этом анализе, затем могут быть непосредственно использованы в протоколе очистки стеклянного молока и повторно протестированы, увеличивая чувствительность к 1 копии вирусной РНК на микролитр. Гибкость, обеспечиваемая использованием непосредственно инактивированных образцов или использованием очищенных образцов, позволяет использовать несколько схем.Кроме того, стеклянная очистка молока с отстаиванием под действием силы тяжести должна быть совместима с роботизированными дозирующими платформами с медленной аспирацией, чтобы гранулы диоксида кремния оставались после промывки. В качестве альтернативы более крупные частицы кремнезема доступны в керамической промышленности. Если используются более крупные размеры, потребуется использовать больший объем частиц, чтобы компенсировать уменьшение отношения поверхности к объему. Однако для некоторых приложений может быть оправдан компромисс при расчетах.

Образец может быть обработан изначально с использованием нескольких наборов праймеров (либо в одной реакции, либо в параллельных реакциях, либо в последовательных реакциях) для обеспечения специфичности и чувствительности.Например, если образцы пациентов тестировались отдельно с помощью тестов Orf1a-HMSe и NEB N-A, двойной положительный результат был бы более определенным положительным результатом. Также возможно, что наборы праймеров, нацеленные на области генома к 3′-концу вируса, которые более многочисленны в субгеномных РНК, таких как ген нуклеокапсида, в инфицированных клетках, будут иметь повышенную чувствительность, если эти РНК будут обнаружены в образцах пациентов (18) . Это не отразилось бы на наших контрольных РНК, которые содержали равные уровни всех геномных областей.Более того, если геномная мутация помешала одному анализу дать положительный результат, второй анализ, нацеленный на другую область генома, все равно мог бы обнаружить вирусную РНК. Также важно, чтобы тесты, используемые для образцов пациентов, включали внутренний контроль, такой как бета-актин, используемый при клинической валидации этого анализа (8), чтобы гарантировать, что целостность РНК в образце сохраняется и отрицательный результат не связан с деградация.

При использовании с образцами пациентов Orf1a-HMSe показал себя очень хорошо, а инактивация значительно повысила предел обнаружения (8).Инактивация и использование праймеров Orf1a-HMSe обеспечили чувствительность ~ 85% от используемого в настоящее время анализа qRT-PCR с высокой чувствительностью (> 95%) для образцов со значениями Ct менее 30, что соответствует образцам с ~ 40 вирионов на микролитр. Оказалось, что стеклянная очистка молока увеличивает чувствительность как минимум в 10 раз. Кроме того, было обнаружено, что специфичность составляет 100% без ложных срабатываний. Несмотря на то, что он не такой чувствительный, как используемый в настоящее время метод qRT-PCR, простота и скорость в самых разных условиях могут все же сделать этот анализ полезным для борьбы с инфекциями.Мало что известно о диапазоне концентраций вируса, который делает человека особенно заразным для других. Люди с очень низкой вирусной нагрузкой, безусловно, менее заразны, и поэтому их идентификация может не иметь решающего значения для снижения распространения вируса. Кроме того, вероятно, будет применяться эпиднадзорное тестирование для достаточно широкого и случайного мониторинга популяций (19, 20). Объединение без очистки может быть достаточным для обнаружения высокоинфекционных особей. Однако, поскольку относительно большие объемы могут быть сконцентрированы с помощью процедуры стеклянного молока, образцы могут быть объединены и очищены по протоколу стеклянного молока, вероятно, без ущерба для чувствительности.Это позволило бы проводить надзорные испытания без значительного увеличения стоимости (21).

Мы понимаем, что многие экспресс-тесты разрабатываются ежедневно и получают одобрение FDA. Однако, учитывая невероятный спрос, необходимы различные тесты с различными компонентами из разных промышленных источников, чтобы решить немедленную нехватку тестов перед лицом широкомасштабной пандемии. Каждый протокол выполняет важную функцию, поскольку разные тесты имеют разные требования, разную чувствительность и разные расходы.

Материалы и методы

Дизайн грунтовки Orf1a-HMS / Orf1a-HMSe.

Первичные олигонуклеотиды для праймеров Orf1a-HMS / Orf1a-HMSe, F3, B3, FIP и BIP были разработаны PrimerExplorer V5 (https://primerexplorer.jp/e/). Праймеры петель (LF и LB) были разработаны вручную, проверены соответствующие температуры плавления с использованием прогнозов программного обеспечения SnapGene.

Олиго.

Все олигонуклеотиды были заказаны в IDT и ресуспендированы в воде UltraPure при концентрации 100 мкМ.Олиго объединяли для получения 100 мкл 10-кратной смеси праймеров следующим образом: 16 мкл FIP, 16 мкл BIP, 2 мкл F3, 2 мкл B3, 4 мкл LF и 4 мкл LB, и доводили до 100 мкл. мкл воды UltraPure.

RT-LAMP Реакции.

Все реакции RT-LAMP проводили, как описано в протоколах NEB (E1700 и M1800), и проводили при 65 ° C. Реакции на основе флуоресценции проводили в виде 10 мкл реакций в термоциклере Bio-Rad CFX96 в течение 60 мин, контролируя каждые 30 с флуоресценцию в канале SYBR. Колориметрические анализы проводили как 25-мкл реакции в течение 30 минут при 65 ° C в термоциклере Eppendorf, за исключением реакций после очистки образцов с помощью 0.От 5 до 1 копий вирусной РНК на микролитр образца, которые обрабатывали в течение 40 минут для улучшения изменения цвета. Колориметрические анализы были получены с помощью смартфона Pixel 2 с настройками по умолчанию.

Контрольная РНК.

Все последовательности вирусной РНК, использованные в этом исследовании, были очищенными контрольными РНК от Twist Bioscience (SKU 102019, 1 × 10 ⁶ копий РНК на микролитр), соответствующим образом разведенных в воде, свободной от нуклеаз. Это были неперекрывающиеся РНК, представляющие фрагменты генома, соответствующие каждому набору зондов.Для проверки концентраций Twist РНК контрольные РНК обрабатывали методом RT и количественно оценивали с помощью цифровой капельной ПЦР (ddPCR) с использованием праймеров HMS Orf1e F3 / B3 и NEB N-A F3 / B3 для их геномных областей. Полученные значения составили 33% и 40%, соответственно, от значений, предоставленных Twist, при условии, что частота RT и обнаружение ddPCR были 100%. Поскольку 100% маловероятно, эти значения RT-ddPCR считались подтверждением заявленных концентраций.

Настройка чистой реакции.

Все реакции были собраны и запечатаны перед запуском в специальной чистой комнате, которая регулярно дезактивировалась отбеливателем и имела ограниченный доступ для персонала.После проведения реакции реакционные пробирки или планшеты больше никогда не открывали, чтобы предотвратить постамплификационное загрязнение будущих реакций.

Решения.

Все растворы были созданы из реагентов молекулярной степени чистоты. Чтобы приготовить 5 мл 100-кратного реагента для инактивации, сначала 358 мг TCEP-HCl (Millipore Sigma 580567) растворяли в воде, чтобы получить 2,5 мл 0,5-М раствора. Затем добавляли 1 мл 0,5 М EDTA, pH = 8 (ThermoFisher Scientific AM9260G). Наконец, добавляли 10 н. NaOH и воду UltraPure (ThermoFisher Scientific 10977015), чтобы довести конечный объем до 5 мл и концентрацию NaOH до 1.От 1 до 1,15 N NaOH (1,1 N для мазков в физиологическом растворе 1 × PBS, 1,15 N для использования со слюной с pH ~ 6,5). Для других сред для сбора необходимо будет оптимизировать концентрацию NaOH, чтобы гарантировать, что pH конечной инактивированной пробы находится в приемлемом диапазоне, чтобы проба при добавлении не вызывала немедленного пожелтения LAMP-реакции или предотвращения LAMP-реакции. не пожелтеть при успешном усилении.

Для приготовления раствора для связывания NaI 224,8 г NaI (Millipore Sigma 793558) растворяли в воде UltraPure до конечного объема ~ 230 мл.К этому добавляли 2,5 мл 1 н. HCl (из 37% исходного материала, Millipore Sigma 320331) и 5 ​​мл tritonX100 и перемешивали перед доведением объема до 250 мл водой UltraPure. Со временем этот раствор может немного пожелтеть, предположительно из-за окисления, которое приводит к образованию молекулярного йода. Однако при добавлении к инактивированному образцу, содержащему TCEP, этот йод быстро восстанавливается, делая раствор бесцветным. Похоже, что это не влияет на очистку. Кроме того, это окрашивание можно предотвратить, уменьшив воздействие света на раствор (например,г., обернув емкость с раствором фольгой).

1 × PBS был приобретен как есть (ThermoFisher 10010023), и 0,9% физиологический раствор был получен путем внесения 1,54 мл 5 М NaCl в 50 мл с водой UltraPure.

Стекло для приготовления молока.

Для приготовления стеклянного молока диоксид кремния 325 меш (Spectrum Chemicals, SI108) был объединен с избыточным объемом 10% HCl (~ 3 н. HCl), полученным из 37% HCl (Millipore Sigma 320331) и воды MilliQ (Millipore). в вытяжном шкафу (нельзя вдыхать сухой кремнезем).После промывки кислотой в течение 4-8 часов при комнатной температуре диоксид кремния осаждали центрифугированием в течение 2 минут при 5000 × г , и супернатант сливали. Гранулы ресуспендировали в четырех объемах гранул воды MilliQ, а затем снова гранулировали. Эту стадию промывки повторяли всего шесть промывок. Затем осадок промывали четырьмя объемами осадка 10 мМ Трис-HCl, pH = 8 (ThermoFisher Scientific AM9855G) и 1 мМ EDTA (ThermoFisher Scientific 15575020) и осаждали. Наконец, осадок ресуспендировали в одном объеме гранулы 10 мМ Трис HCl и 1 мМ ЭДТА и автоклавировали.Однако этот этап автоклавирования, вероятно, излишний, поскольку промывка кислотой должна очищать шарики от загрязняющих веществ. Полученная 50% стеклянная суспензия молока может храниться при комнатной температуре. Перед использованием необходимо тщательно ресуспендировать частицы, поскольку они начинают быстро оседать.

Определение активности РНКазы. Активность РНКазы

тестировали с использованием субстрата IDT RNaseAlert (IDT 11-04-02-03). Вкратце, субстрат обнаружения (олигонуклеотид РНК с фтором и гасителем) ресуспендировали в воде UltraPure при концентрации 10 мкМ.Для каждого теста 5 мкл этого субстрата и 5 мкл 10-кратного буфера объединяли с 40 мкл раствора, который тестировался на активность РНКазы. Тестовый раствор для проверки активности РНКазы в NaI был создан путем погружения и энергичного взбалтывания аппликатора с ватным наконечником (Puritan 806-WC), который был тщательно протерт в задней части горла, в 500 мкл указанного раствора NaI. Положительный контроль был создан путем погружения тампона в воду, а отрицательный контроль содержал чистую воду UltraPure без каких-либо добавок.Для тестирования влияния температуры инактивации на инактивацию РНКазы с флуоресцентным считыванием мазки из зева аналогичным образом помещали в физиологический раствор с 1 × реагентом для инактивации, причем отрицательный контроль состоял из этого раствора без добавления тампона. Затем эти реакции инкубировали в течение 30 или 60 минут для NaI и тестов на инактивацию, соответственно, при 37 ° C и отображали в светлом поле и 488 нм с помощью стереоскопа Leica.

Мок-образцы.

Образцы мазков были созданы как в физиологическом растворе, так и в 1 × PBS.Чтобы смоделировать типичный сбор мазков, один НЧ и один ротоглоточный мазок погружали и перемешивали в 3 мл любого раствора. Для сбора слюны сначала полоскали рот водой. Через 30 минут без еды и питья была собрана слюна.

Инактивация образцов и прямое тестирование RT-LAMP.

Во всех экспериментах с инактивированными образцами использовались либо имитирующие образцы мазков, либо контрольные образцы слюны и РНК. К каждому образцу добавляли 1/100 объема 100 × инактивирующего реагента. Затем образцы были смешаны и помещены в термоблок, установленный на 95 ° C.Через ~ 2 мин, когда образцы достигли 95 ° C, были добавлены РНК положительного контроля, и продолжалась оставшаяся 5-минутная инактивация. Затем образцы охлаждали на льду. Для тестирования остаточной активности РНКазы образцы после охлаждения помещали на 30 мин при 37 ° C, а затем снова помещали на лед. Для тестирования RT-LAMP 5 мкл образца добавляли к 20 мкл 1,25-кратной колориметрической смеси RT-LAMP, содержащей набор праймеров Orf1a-HMSe. Для проверки стабильности образцов, инактивированных при различных температурах, инактивацию проводили в течение 5 мин при указанной температуре.Для инактивации реагентом для инактивации при нейтральном pH готовили 100-кратный реагент для инактивации с 0,75 М NaOH. После инактивации, непосредственно перед добавлением образца в реакцию, добавляли 1/100 объема 0,35 М NaOH, чтобы довести pH образца до надлежащего щелочного диапазона, необходимого для колориметрического считывания.

Очистка образцов — с помощью центрифуги.

Во всех экспериментах по очистке использовалось 500 мкл образца (тампоны или слюна), и они проводились в пробирках объемом 1,5 мл (Fisher Scientific 14-222-155), коническая форма которых обеспечивала очень эффективное удерживание гранул диоксида кремния.Образцы инактивировали, как описано выше, и охлаждали. Для очистки слюны эти образцы центрифугировали при 2000 × g в центрифуге VWR Galaxy Mini в течение от 10 с до 15 с, и очищенный супернатант переносили в свежую пробирку для очистки. Этот шаг был пропущен для образцов мазков. Затем добавляли 250 мкл реагента, связывающего NaI, вместе с 5 мкл стеклянного молока (их можно было заранее объединить в формат мастер-микса, по 255 мкл которого было добавлено в каждый). Затем пробирки перемешивали путем переворачивания и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин; их переворачивали каждые 2 мин для ресуспендирования кремнезема.Затем образцы центрифугировали от 2 до 3 с при 2000 × г для осаждения диоксида кремния, и супернатант сливали. Затем добавляли 700 мкл 80% этанола и пробирки переворачивали два или три раза для промывки (осадок не нужно ресуспендировать). Образцы снова центрифугировали от 2 до 3 с, и супернатант сливали. Образцы центрифугировали в последний раз, чтобы весь остаточный 80% этанол опустился на дно. Для удаления остаточного раствора из осадка использовалась микропипетка или пипетка для переноса с тонким наконечником (например, Thomas Scientific 232-11).Затем гранулы полностью сушили на воздухе (до тех пор, пока они не стали напоминать сухой пергамент), оставляя пробирки открытыми при комнатной температуре или в нагревательном блоке 65 ° C для более быстрого высыхания. Затем добавляли 25 мкл 1 × колориметрической смеси RT-LAMP с праймерами Orf1a-HMSe и осадок ресуспендировали пипетированием или встряхиванием. Реакцию переносили в пробирку для ПЦР объемом 0,2 мл перед проведением при 65 ° C в течение 30 мин (этот формат пробирки упрощает визуализацию).

Очистка образцов — без центрифуги.

Очистка с использованием только силы тяжести для осаждения частиц диоксида кремния была успешной только с использованием тампонов, а не слюны.Пятьсот микролитров образца были инактивированы, и РНК была связана с диоксидом кремния с помощью реагента, связывающего NaI, как описано выше для использования с центрифугой. Затем образцы оставляли в покое в течение 5-10 минут, чтобы дать кремнезему осесть, и супернатант сливали (в супернатанте остаются некоторые мелкие частицы, которые будут мутными, но значительное количество кремнезема осядет на дно. трубки). Затем добавляли 700 мкл 80% этанола и пробирки переворачивали два или три раза для промывки (осадок не нужно ресуспендировать).Образцам давали отстояться от 2 до 3 минут, и супернатант сливали. Добавляли дополнительно 700 мкл 80% этанола, и образцы оставляли на от 2 до 3 минут. Затем супернатант удаляли пипеткой для переноса с тонким наконечником умеренно медленно (от 2 до 3 с), чтобы осталось как можно меньше 80% этанола. Затем гранулы полностью сушили на воздухе (до тех пор, пока они не стали напоминать сухой пергамент), оставляя пробирки открытыми при комнатной температуре или в тепловом блоке 65 ° C для более быстрой сушки. Затем проводили реакции, как описано выше для очистки на центрифуге.

Очистка образцов с помощью коммерческих сред для сбора.

Вирусная РНК была добавлена ​​непосредственно в чистые образцы Quest Diagnostics VCM или PrimeStore MTM. Для образцов VCM (750 мкл) добавляли 1/100 объема 100 × инактивирующего реагента, описанного выше, и образцы нагревали при 95 ° C в течение 5 минут и охлаждали. Затем образцы VCM центрифугировали при 10000 × g в течение 15 с для осаждения желатина на дне пробирки, и очищенный супернатант переносили в свежую пробирку (2/3 исходного объема пробы, 500 мкл). .Затем добавляли половину этого очищенного объема надосадочного раствора связывающего раствора NaI с дополнительными 12,5 мМ HCl вместе с 5 мкл стеклянного молока. Затем очистку проводили на центрифуге, как описано выше. Для образцов в PrimeStore MTM инактивация не проводилась. Добавляли половину объема образца связывающего раствора NaI и 5 мкл стеклянного молока, а затем проводили очистку на центрифуге, как описано выше.

Доступность данных.

Все данные исследования включены в статью SI и приложение .

Благодарности

Эта работа была поддержана Медицинским институтом Говарда Хьюза. Мы благодарны Натану Таннеру из NEB за обмен идеями и реактивами. Мы также выражаем благодарность за полезные обсуждения с Майклом Спрингером из отдела системной биологии HMS, особенно в отношении предложений по этапу инактивации. При разработке этих анализов нас также направили в ходе полезных обсуждений с нашими коллегами Мелис Анахтар и Грэхем МакГрат из отделения клинической микробиологии Массачусетской больницы общего профиля.Мы благодарим Дженн Эттер, руководителя исследовательской работы отдела генетики HMS, а также сотрудников службы безопасности, оборудования и доставки HMS за поддержку нашей работы в это непростое время. Мы также благодарим Элизабет Рэйб, Джозефа Рэба и Майкла Берка за их помощь в редактировании этой рукописи.

• Copyright © 2020 Автор (ы). Опубликовано PNAS.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в cookie-файлах может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

50 дешевых рождественских подарков 2021: лучшие недорогие праздничные подарки

Предоставлено

Если каждый праздничный сезон у вас очень длинный список покупок с друзьями, семьей и другими близкими, вы, вероятно, опасаетесь того, как будут выглядеть выписки по вашей кредитной карте в следующие несколько месяцев.

Ага, отпуск определенно можно приравнять к тратить много денег. Но так быть не должно. Вы можете полностью сэкономить на бюджете с этим тщательно подобранным списком лучших дешевых рождественских подарков.

Ключ к покупке дешевого рождественского подарка (который не кажется бюджетной покупкой) — это отточить хобби получателя, чтобы придумать этот маленький, но потрясающий подарок, который сделает его любимое времяпрепровождение еще более приятным.

Неважно, для кого вы делаете покупки — от вашей мамы на природе до подруги-гурмана или сестры-наркомана-красотки — я собрал несколько симпатичных, но недорогих вариантов, которые они на самом деле будут использовать.Ваша двоюродная сестра, любящая хлопья, будет одержима этой портативной чашкой, которая позволит ей наслаждаться Cheerios на ходу. Вашему папе, любящему отдых на природе, понравится этот удобный походный гамак, который он сможет использовать во время следующей ночной экскурсии по лесу. И практически любой в вашем списке скажет вам большое старое «спасибо вам огромное !!» для этого аааа-лабиринта массажера для кожи головы (да, даже для твоего брата).

Продолжайте читать, чтобы узнать о 50 лучших недорогих, совершенно доступных, но все же классных рождественских и праздничных подарках, которые можно подарить всем самым важным людям в вашей жизни в 2021 году.

Реклама — продолжить чтение ниже