Размеры блоков фбс: цены, размеры ФБС 24 6, 24 4 – МЕТАЛЛОМАРКЕТ в Москве

что такое, размеры, под фундамент в строительстве

Довольно распространенным способом возведения фундамента является применение бетонных блоков. Фундаментные блоки ФБС могут использоваться без опалубки, к тому же они имеют крайне высокую прочность.

При возведении на слабой почве блоки опирают на специальные покрытия, которые помогают уменьшить нагрузку на грунт.

В данной статье будет более подробно рассмотрено, что такое ФБС, его виды и способ применения в строительстве.

Типы фундаментных блоков

Плиты ФБС удобно использовать для монтажа фундамента

Довольно популярным видом является ФБС, расшифровывается который как сплошной бетонный фундаментный блок. Его применяют для монтажа под наружные и внутренние поверхности.

Различают следующие размеры фундаментных блоков ФБС:

• если длина изделия составляет 2,38 м, толщина плит ФБС может варьироваться от 30 до 60 см. Высота при такой длине составляет 58 см;
• при длине 1,18 м, существует 3 вида толщины: 40, 50 и 60 см. При этом высота может быть либо 28, либо 58 см;
• короткие изделия. Имеют длину в 0,88 м. Толщина может варьироваться от 30 до 60 см. Высота такого ЖБИ стандартная в 58 см.

Масса ЖБИ зависит от размера и может находиться в пределах от 380 до 1960 кг. Все возможные размеры сплошных блоков можно увидеть на следующей схеме.

Преимущества бетонных блоков

Такие изделия имеют ряд существенных плюсов перед другими материалами. К ним можно отнести:

1. Уменьшение продолжительности работы. Если использовать для строительства фундамента способ с заливкой бетона в опалубку ждать понадобится около месяца, пока раствор наберет свою прочность.
2. Стандартные размеры. Этот параметр позволит точно рассчитать нужное количество изделий.
3. Экономичность. Не понадобится приобретать дорогие материалы в виде досок для опалубки, химических добавок против замерзания и прочего. Сами ЖБИ не отличаются высокой стоимостью, их цена во многом зависит от вида.
4. Большой ассортимент изделий. Возможность выбора согласно нужным параметрам: водостойкость, защита от мороза или агрессивных химических веществ.
5. Высокий срок эксплуатации. При правильной установке и аккуратном использовании материал может прослужить более века.

Маркировка блоков

Легкий бетон маркируется буквами “Л” или “П”

Чертой маркировки всех блоков для постройки дома является округление размеров до дециметров.

Если материал производится из легкого бетона, то после цифры идет маркировка «Л» или «П», которая расшифровывается, как наличие в составе керамзита.

Если после цифровых обозначений стоит буква «С», это означает, что при изготовлении завод ЖБИ применял бетон на основе силиката. Минимальный вес такого ЖБИ составляет 250 кг, а максимальный 1,63 т.

Все фундаментные блоки имеют размеры и оснащаются 2 петлями из стали с большим диаметром. Они используются для установки, погрузки и разгрузки.

Расчет и установка блоков

Швы между блоками ослабят прочность конструкции

Произвести все подсчеты не так сложно, как может показаться.

Для этого понадобится выявить объем возводимого основания и разделить на объем одного изделия.

Результат будет соответствовать нужному количеству материала.

По поводу этажности возводимой постройки можно не переживать. Прочности ФБС блоков хватит для того, чтобы выдержать пятиэтажное помещение.

Более важным критерием для такого материала является состояние почвы. Необходимо брать во внимание одну из особенностей блоков – их невысокую монолитность. В отличие от сплошного ленточного изделия блочный фундамент имеет швы, которые ослабляют конструкцию.

Перед тем как устанавливать блоки под фундамент, на дно траншеи понадобится залить монотонный бетонный пояс. Он возьмет на себя основную нагрузку, которая появится при замерзании или увлажнении грунта. Если фундамент здания высокий, рекомендуется использовать армопояс с интервалом через два ряда блоков.

Хорошая почва для блоков должна иметь большое количество песка и глубокое залегание воды. Эти критерии встречаются редко, поэтому зачастую блочный ростверк необходимо усиливать. Помимо армопояса каждый ряд блоков обрабатывается бетонной смесью с толщиной не меньше чем в 3 см. При этом марка бетона должна быть не ниже М 150.

Подготовка основания

Для фундамента под блоки своими руками понадобится сделать песчаную подсыпку. Она служит в качестве выравнивающего слоя, при этом ее толщина не должна превышать отметку в 15 см. Если работа проводится на сухих песчаниках, блоки можно устанавливать прямо на грунт. О том, как сделать лучшую основу для ФБС-фундамента, смотрите в этом видео:

Если возведение осуществляется на проблемной почве, для увеличения прочности под блоки предварительно устанавливают железобетонные фундаментные покрытия.

Установка фундамента из бетонных блоков

Очень крупные блоки придется монтировать с помощью техники

Согласно нормам, запрещено устанавливать бетонные блоки под фундамент, если дно ямы завалено снегом или залито большим скоплением воды.

Если размеры блоков ФБС для фундамента большие, их перемещение осуществляется при помощи подъемного крана.

Первым делом блоки монтируют в углах фундамента и точках соприкосновения внутренних стен. Они служат в качестве монтажных маяков.

При помощи нивелира проверяется правильность размещения, между изделиями натягивают шнур и по нему устанавливаются промежуточные блоки. В участках, где планируется проводка, оставляются отверстия нужных размеров.

Перед монтажом железобетонные блоки для фундамента необходимо очистить от загрязнений и смочить водой. Установка осуществляется на бетонной смеси, при этом все швы перевязываются. Швы также обрабатываются смесью, которая уплотняется штыковой лопатой. Маркировка бетона при такой работе может быть разная в зависимости от того, какого блок ФБС размера. Подробнее о монтаже основания смотрите в этом видео:

При приобретении блоков для дома рекомендуется запросить у продавца сертификат соответствия. Эта бумага гарантирует качество изделия и полностью соответствует требованиям ГОСТ.

Как видно из статьи, фундаментные блоки можно использовать для возведения фундамента и стеновых конструкций. Даже маленькие по размеру изделия отличаются высокой прочностью и качеством, а их срок эксплуатации действительно впечатляет.

Железобетонные блоки для фундамента ФБС

Любое сооружение должно иметь надежную основу, на которой оно будет возводиться. От фундамента зависит долговечность и безопасность эксплуатации любого здания. Это относится и к промышленным сооружениям, и к жилым домам, и к небольшим постройкам на загородном участке.

Ранее мы уже рассматривали От чего зависит выбор фундамента на участке строительства. Если вы читали эту статью, то вам уже известно, что в первую очередь геометрические параметры, глубина заложения и прочность фундамента зависят от нескольких основных определяющих величин:

• глубины промерзания грунта на участке;
• пучинистости грунтов основания;
• веса возводимой постройки.

Виды фундаментов

Если строение имеет небольшие размеры и вес, а грунты на участке не предрасположены к пучинистости (например, песок), то фундамент может быть мелкого заложения. Это могут быть простые в устройстве бутовые или бутобетонные фундаменты. Достаточно выкопать небольшую канаву по периметра строения, засыпать ее камнями и залить раствором, чтобы получить вполне надежное основание.

Также широко используются рамные фундаменты мелкого заложения, представляющие собой армированный монолитный каркас, удерживающий вес строения. Такие фундаменты можно использовать и при незначительной пучинистости грунтов, если сооружение возводится из бруса, бревен или при постройке каркасного типа.

Но все эти виды оснований можно устраивать лишь при незначительном весе возводимого сооружения и благоприятных грунтовых условиях. Если же возникает необходимость строительства здания из кирпича, то требования к фундаментам значительно возрастают. Вес строения в этом случае многократно увеличивается — кубометр кирпичной кладки весит около 2 тонн! А если сюда добавить массу железобетонных перекрытий и крыши, вес здания получается довольно внушительным.

В этом случае используют сборные железобетонные фундаменты из блоков.

Плюсы бетонных блоков

К плюсам блоков из бетона можно отнести следующие показатели:

1. Очень высокая прочность, возможность использовать для возведения тяжелых зданий из кирпича.
2. Универсальность и широкий размерный ряд.
3. Устойчивость к внешним факторам, долговечность (не менее 50 лет).
4. Стандартизация размеров, позволяющая использовать в самых разных проектах и легко подсчитывать необходимое количество изделий для составления строительной сметы.
5. Простота укладки и высокая скорость монтажа.

Размеры блоков ФБС

В зависимости от исполнения фундаментные блоки могут иметь следующие обозначения:
— ФБС — стеновые сплошные;
— ФБВ — сплошные со специальным вырезом для пропуска коммуникаций;
— ФБП — с открытыми вниз пустотами.

Наиболее универсальными и часто используемыми являются блоки ФБС, из которых возводят цокольные части зданий, подвалы, технические подполья зданий. Благодаря большому разнообразию форм и возможности выбора нужного размера блоки ФБС можно использовать при проектировании и строительстве сооружений самого разного назначения.

Геометрические размеры производящихся сегодня фундаментных блоков ФБС имеют высоту 300мм или 600мм и ширину от 300мм до 600 мм с шагом в 100мм (300, 400, 500, 600). Длина железобетонного фундаментного блока ФБС может составлять 600, 800, 900, 1200 и 2400мм.

Все геометрические параметры блоков легко определить по их маркировке. Например, маркировка 24-6-6 будет означать, что данный блок имеет длину 2400мм, а его ширина и высота — 600мм. Если в маркировке используется буква «т», это означает, что блоки изготовлены из тяжелого бетона.

Важно! Обратите внимание, что размеры округляются с учетом толщины раствора. Высота 600 мм означает толщину самого блока 580мм плюс 20мм на раствор.

Таблица размеров фундаментных блоков ФБС

Марка блока	Размеры блока, мм			Вес блока, кг
	Длина	Ширина	Высота
ФБС 9-3-3	900	300	300	180
ФБС 9-3-6	900	300	600	320
ФБС 9-4-6	900	400	600	480
ФБС 9-5-6	900	500	600	540
ФБС 9-6-6	900	600	600	640
ФБС 12-3-6	1200	300	600	450
ФБС 12-4-3	1200	400	300	280
ФБС 12-4-6	1200	400	600	580
ФБС 12-5-3	1200	500	300	350
ФБС 12-5-6	1200	500	600	730
ФБС 12-6-3	1200	600	300	420
ФБС 12-6-6	1200	600	600	880
ФБС 24-3-6	2400	300	600	900
ФБС 24-4-6	2400	400	600	1200
ФБС 24-5-6	2400	500	600	1500
ФБС 24-6-6	2400	600	600	1800

 

Изготовление бетонных фундаментных блоков

Блоки ФБС изготавливают из силикатного бетона с плотностью не менее 1800кг/м.куб. в специальных металлических формах, совмещенных с вибропрессом.

Загрузка бетона в форму производится с помощью специального ковша, из которого смесь перемещается в форму. Для перемещения готового изделия непосредственно в тело блока устанавливаются закладные в виде петель.

Как происходит формирование блоков ФБС вы можете посмотреть в этом видео:

Укладка фундаментных блоков

Укладка блоков производится с перевязкой, как и кирпичная кладка. Такая разбежка швов позволяет значительно повысить конструктивную прочность готового фундамента.

Подъем блоков производится краном. Стропы цепляют к петлям и перемещают блок к месту монтажа, где устанавливают на слой раствора.

Горизонтальность и вертикальность установки фундаментных блоков контролируется с помощью гидравлического уровня:

Смотрите также:

Последние публикации:

Даже правильно выложенной кирпичной печи, со временем требуется ремонт. Высокие температуры, нарушение тяги, механические повреждения кладки – все это приводит к появлению дефектов, которые требуют устранения. Ведь хорошая тяга и отсутствие трещин в стенках –… Читать… Выбор печей для бани сегодня очень широк. Промышленностью выпускаются каменки на любой вкус и цвет. Вы можете подобрать готовую печь для установки в бане в соответствии с требуемой теплопроизводительностью в зависимости от объема парной и выбрать нужный… Читать… Для того, чтобы попариться в баньке сегодня вовсе не обязательно выкладывать основательную русскую печку, кладка которой под силу лишь опытным печникам. Сегодня промышленным способом выпускается большой ассортимент металлических каменок, обеспечивающих… Читать…

• < Желтый силикатный кирпич
• Силиконовый герметик для наружных швов >

размеры и порядок применения для строительства фундаментнов

Самым востребованным материалом для возведения фундаментов считаются бетонные блоки.

Формы ФБС, прочность и имеющиеся размеры помогают подобрать оптимальные элементы, которые соответствуют параметрам проекта.

Чтобы этот выбор был правильным, следует брать во внимание прочность фундамента, чтобы он хорошо поддерживал здание. Для этого его необходимо распределить равномерно по грунту.

Разновидности блоков

Все виды блоков соответствуют ГОСТу

Технические данные: формы для ФБС, характеристики прочности и другие размеры регламентируются Государственными стандартами.

Самым распространенным видом считается сплошное фундаментное устройство, которое имеет в сокращении название ФБС. Применяют его для возведения несущих внутренних и наружных стен.

Установленный ГОСТ указывает на необходимые формы для блоков ФБС, а также их размеры и характеристики:

• если изделие имеет длину 2,38 м, толщина может быть 30 – 60 см, в высоту они все одинаковые – 58 см;
• при длине 1,18 м толщина составляет три величины: 40, 50, 60 см, а высотой они будут 28 и 58 см;
• доборныеблоки ФБС размерами, которым соответствует длина – 0,88 мм, толщина от 30 до 60 см, со стандартной высотой 58 см, применяются они для того, чтобы не нарушать целостность полномерного устройства;
• вес стандартного изделия составляет 380 – 1960 кг с плотностью 2400 кг/м3.

Технические особенности

Размеры блоков

Изготовитель обязан обеспечить блоки ФБС размерами, соответствующими ГОСТу с необходимыми свойствами и геометрическими параметрами. Любое несоответствие может негативно отразиться на постройке, привести к порче здания.

Блоки ФБС передают форму параллелепипеда, изготовленного из различных видов бетона: силикатного, керамзитового и бетонного. Плотность его составляет 1800 кг/м3, пустот не имеет, но содержит технологическую формовку для армирования по вертикали кладки раствором. Размерами 200х200х400 и классом прочности не менее чем В 7,5.

Изготавливаются и уплотняются конструкции на вибростолах, создается необходимый размер блоков ФБС, гладкость поверхности, а также плотность специальными опоками. Неправильная геометрия изделий не позволит выполнить ровную кладку, а швы по толщине могут превышать норму, которая соответствует 2 – 5 мм.

Плотная и качественная поверхность ЖБИ предотвращает растрескивание и разрушение при повышенной влажности.

Таблица размеров на блоки, которая регламентируется ГОСТом.

Фундамент из блоков ФБС

Обычно после букв, которые указывают на тип изделия, присутствует набор цифр. Они указывают на габариты и, как правило, измеряются в дециметрах.

Первое число указывает, какая длина устройства, вторая – ширина, а третье значение – это высота.

Габаритные размеры фундаментных блоков указываются с округлением к большему значению. Вес даже самых незначительных изделий доходит до 260 кг.

Для работы с ними необходимо использовать тяжелую специальную технику. Железобетонные блоки для фундамента значительно сокращают время возведения фундамента.

Типы и размеры

Хорошей опорой для ленточного фундамента станут трапецевидные блоки

Форму для фундаментных блоков и профилей можно выбрать различную:

• для возведения свайного либо столбчатого фундамента применяются цилиндрические колонны;
• прекрасной опорой для ленточного либо столбчатого основания будут служить трапециевидные устройства;
• для возведения стеновой конструкции цокольных этажей используется прямоугольная форма, содержащая на торцах выемки в виде дуги;
• для обустройства несъемной опалубки из бетона применяют пустотелые изделия;
• иногда необходимы для строительства балки, которые имеют прямоугольное либо трапециевидное сечение, все размеры блоков ФБС, их объем указаны в ГОСТ.О том, как строятся фундаменты из блоков ФБС, смотрите в этом видео:

Некоторые изготовители предоставляют виды изделий с небольшой массой. Они изготавливаются из различных видов силикатного либо керамзитового бетона.

Внутренность таких фундаментных блоков ФБС может содержать пустоты либо быть пористыми.

Таблица форм

Все эти блоки устанавливаются кранами или в крайнем случае лебедками. Но, есть изделия, которые изготавливаются размером 20х20х40 см. Они выливаются на фабрике стандартными формами. Процесс вибропрессования значительно уплотняет раствор.

Для изготовления таких изделий используется портландцемент и песок с добавлением мелкого заполнителя. В его качестве может быть гравий либо керамзит.

Использовать такие фундаментные блоки своими руками следует для небольших зданий, имеющих незначительный удельный вес. Масса их составляет не более 40 кг. О том, как происходит процесс формования блоков ФБС на производстве, смотрите в этом видео:

Используя такой материал, необходимо создавать дополнительные пояса для армирования. Иногда в каждый шов по горизонтали укладывают сетку, изготовленную из металла. Чтобы повысить прочность, можно дополнить конструкцию армирующим поясом на большую высоту.

Все выполняемые процессы зависят от существующих условий на выбранном для фундамента участке, большое значение имеет конструкция самого здания.

Фундаментные блоки: размеры по ГОСТ

На сегодняшний день при сооружении несущих строительных конструкций применяют различные фундаментные блоки размеры, вид и маркировка которых говорит о предназначении данного материала и его применимости.

От прочности каждого уложенного блока несущей конструкции зависит качество всего здания. Выполняя устройство фундамента важно использовать материалы, которые имеют устойчивость к агрессивной среде почв, не говоря о низких температурах и влаге. Таким материалом, специально предназначенным для устройства фундамента, являются бетонные блоки ФБС.

Что они собой представляют? Это изделие, изготовленное из бетона высокого класса, и применяются для возведения различных фундаментов, например, ленточных или столбчатых. Также они хорошо подходят для строительства гаражей, различных подвальных, цокольных, технических построек.

При изготовлении таких бетонных изделий применяются разные марки бетона: от М100 до М200. Различаются они также по технологии производства и наличию или отсутствию армирующего каркаса.

Маркировка для фундаментных блоков

Применение пустотелого блочного матариала малого размера для возведения несущей строительной конструкции

• Ф – бетонные, а также железобетонные, выполненные с добавлением крупных фракций. Применяются специально под колонны скатного типа;
• ФЛ – железобетонные конструкции с добавлением гранитных фракций, для укладки ленточных фундаментов;
• ФБС – бетонные изделия, не имеющие армирующего каркаса, применяются для строительства технических зданий, подвалов, а также фундаментов;
• БФ – железобетонные, пригодны для построения стен внутри, а также снаружи различных зданий. Применяются как для сельскохозяйственных, так и промышленных построек;
• ФБП – бетонные, пустотелые изделия, используются, как самостоятельный строительный материал для сооружения ленточного фундамента. Также можно его использовать как форму для монолитной ленты.

Цифры, стоящие с заглавными буквами в маркировке изделий, означают размеры длины, ширины и высоты, измеряемых в дециметрах.

Преимущества фундаментных блоков

Высокая скорость монтажа. Нет необходимости в устройстве и демонтаже опалубки, не нужно выделять время для застывания монолитной ленты. На такой конструкции можно сразу возводить запланированное здание. Кроме того:

• Качество. Все изделия в процессе изготовления на предприятии проходят специальную проверку на соответствие размера по ГОСТу.
• Прочность. Процесс производства фундаментных блоков включает вибрирование, а также пропарку, что придает им необходимой крепости.
• Доступность и надежность. По сравнению с другими строительными изделиями они приемлемы в цене. Процессы изготовления, начиная от расчета размеров, заканчивая замесом бетона, автоматизированы.
• Универсальность. Применяются фундаментные блоки для возведения одноэтажных, а также многоэтажных зданий, все зависит от размера. С их помощью монтируется в короткие сроки самый трудный «нулевой цикл» практически любого строения.
• Удобство. Одинаковые размеры фундаментных блоков, изготовленных для фундамента, имеют на торце пазы, вмонтированные петли, которые намного упрощают работу.
• Устойчивость в критичных условиях. Добавки, имеющиеся в составе секций, позволяют использовать их в регионах, где наблюдается повышенная кислотность грунта, а также очень низкая температура.

К недостаткам бетонных блоков относится то, что при устройстве фундаментных блоков необходимо выполнять двойную гидроизоляцию. Кроме того, между фундаментными швами нужно производить утепление. Прекрасно для этого подойдет пенополистирол, который не только утеплит основу, а также продлит эксплуатацию конструкции.

Подбор бетонных фундаментных секций

Пустотелые и сплошные бетонные блоки

Кроме габаритов изготовленного блока и марки бетона, стойкость на сжатие определяют:

1. Прочность здания, которое будет возводиться.
2. Технологическая разработка сборки отдельных элементов.
3. Сроки выполнения работы начального этапа.
4. Стоимость фундаментных блоков.

Что влияет на выбор размера блоков, предназначенных для фундамента:

• прочность земельного участка;
• тип грунта;
• вес строения, который определяется: применяемыми материалами и габаритами;
• требования, которые выдвигаются к конструкционной устойчивости фундамента;
• вид кладки;
• размер и площадь фундамента.

Если грунт на участке неустойчивый, размеры несущих конструкций должны быть больше. К примеру, на глинистых грунтах (они сами влияют на конструкцию) профессионалы рекомендуют применять крупногабаритные блоки ФБС. Песчаные грунты при закладке на глубину около 70 сантиметров можно использовать средних размеров ФБС.

Ширина бетонной секции и толщина стен неодинакова. Выступ стены допускается до 10 сантиметров с одного края, а если это двухсторонние выступы, то с каждой стороны до 5 сантиметров. Для более плотной укладки и приемлемой перевязки швов необходимо применять блоки совершенно разных размеров.

Бетонные фундаментные секции, изготовленные по ГОСТу, имеют высокую точность в размерах, а также прямолинейности. Это позволяет избежать кривизны при выполнении комбинированной конструкции, служит прекрасным ориентиром для последующей выгонки стен.

Зачем знать вес и размеры бетонных блоков

ГОСТ на фундаментные блоки кроме габаритных размеров рассматривает еще норму в массе. Это нужно для контроля качества, потому, что норму плотности бетонной смеси невозможно установить на строительной площадке.

Также данные нужны для подбора специальной техники, которая будет укладывать, транспортировать или выполнять погрузочно-разгрузочные процессы. Бетонные конструкции для фундамента, размер и масса которых известны, определяют нормативную погрузку в машины, которые транспортируются 10 или 20 тонными автомобилями. Имея точную информацию можно сэкономить средства на транспорт.

FBS-2 FabNut 3/8 «Фиксирующая распорная шайба

В чем разница между таблицами?

-PRO Столешницы

• Изготовлены из стали HRPO A36
• Опорная конструкция ребра высотой 2 дюйма
Структура верха и ребра толщиной 3/16 дюйма
• Конструкция выступа и паза для легкой сборки
• Лазерная резка для жестких допусков
• Отверстия 16 мм для зажимов и приспособлений
• Нет возможности расширения

-Mini-Block

• Тот же материал и допуски, что и у PRO Top
• 4-дюймовая структура с ребрами и боковые стороны
• Трехмерные рабочие поверхности с 5 сторон
• Совместимость с fabWings, тисками и большинством аксессуаров для бокового крепления
• Можно скреплять болтами практически неограниченное количество конфигураций !
• Более тяжелая нагрузка, чем топы PRO

-FabBlocks

• Тот же материал и допуски, что и у PRO и Mini
• 6 Структура с глубокими ребрами ”или 8” (в зависимости от длины) для прочности и плоскостности
• Доступны из материала ¼ ”, 3/8” или ½ ”.
• Повышенная жесткость — конструкция коробки полного кручения.
  Доступны с отверстиями 16 мм или с резьбой. (Резьба 3/8 ”-16 или ½” -13 доступна в зависимости от толщины)

Примечание : FabBlock и мини-блок имеют стороны с нашим стандартным расположением отверстий и могут быть расширены с помощью наши фабрики или путем соединения нескольких блоков болтами. Варианты размеров и конфигураций практически безграничны с таблицами стилей Mini-Block и FabBlock!

КАКИЕ НОГИ МНЕ НУЖНЫ?

• В профессиональных столах используется один из комплектов ножек для тяжелых условий эксплуатации.
• Мини-блоки, FabBlocks и плазменные столы используют наш FabRack.
• FabRacks можно купить с роликами или без них!

МОГУ ЛИ Я ПОЛУЧИТЬ ПРОФЕССИОНАЛЬНЫЙ СТОЛ БОЛЬШЕ / БОЛЬШЕ?

• Мы не предлагаем стол Pro из более толстого материала. Из-за конструкции реберной конструкции они ограничены по размеру (наибольшая 3х4) и толщине.

Зачем мне нужны резьбовые отверстия?

• Резьбовые отверстия очень удобны для прикручивания ваших приспособлений или аксессуаров к столу.Резьбовые отверстия — самый быстрый способ разместить вещи на столе.
• Если вы заказываете отверстия с резьбой, стороны стола также будут иметь резьбу.
• Pro столы не доступны с резьбовыми отверстиями из-за недостатка материала. Чтобы прикрепить аксессуары к профессиональным столам, вы можете использовать детали FBN-2 и FBS-2, установочную шайбу fabnut и fabnut.

ЕСТЬ ЛИ У ВАС НАЧАЛЬНЫЙ ПАКЕТ / ПАКЕТ ACC?

• У нас есть упаковка из 4 квадратов со скидкой, запчасти VFS-2 и VFS-4.Все остальные аксессуары заказываются по меню.

КАК РАБОТАЮТ FABNUTS / SPACERS?

• Гайки с резьбой и уплотнительным кольцом. Они вставляются в отверстие 16 мм на нижней стороне стола и удерживаются уплотнительным кольцом.
• Fabspacer подходит для отверстий 16 мм на наших аксессуарах и позволяет вам точно разместить их с помощью болта 3 / 8-16.

ВЫ ПРЕДЛАГАЕТЕ СБОРКУ?

• Мы предлагаем монтаж на дому нашими профессиональными сварщиками.Стоимость зависит от размера стола или аксессуара.
• По вопросам тарифов обращайтесь по адресу [email protected]

КАКОЕ ВРЕМЯ ПОДГОТОВКИ?

• Это зависит от нашей загруженности, в настоящее время доставка занимает около 10-14 рабочих дней.

Истощение внеклеточных пузырьков из фетальной бычьей сыворотки изменяет пролиферацию и дифференцировку клеток скелетных мышц in vitro | BMC Biotechnology

1.

Carrel A, Ebeling AH. Возраст и увеличение фибробластов.J Exp Med. 1921; 34: 599–623.

CAS Статья Google ученый

2.

Treadwell PE, Ross JD. Характеристика человеческих клеток: изменение скорости роста, объема, морфологии и эффективности роста в средах с добавлением человеческой сыворотки или бычьей эмбриональной сыворотки. Exp Cell Res. 1963; 29: 356–79.

CAS Статья Google ученый

3.

Кирикаэ Т., Тамура Х., Хашизуме М, Кирикаэ Ф., Уэмура Ю., Танака С., Йокочи Т., Накано М.Загрязнение эндотоксином фетальной бычьей сыворотки и его влияние на продукцию фактора некроза опухоли макрофагоподобными клетками J774.1, культивируемыми в присутствии сыворотки. Int J Immunopharmacol. 1997; 19: 255–62.

CAS Статья Google ученый

4.

Ходабукус А., Баар К. Влияние сывороточного происхождения на тканевую инженерию функции скелетных мышц. J Cell Biochem. 2014; 115: 2198–207.

CAS Статья Google ученый

5.

Camussi G, Deregibus MC, Bruno S, Cantaluppi V, Biancone L. Экзосомы / микровезикулы как механизм межклеточной коммуникации. Kidney Int. 2010; 78: 838–48.

CAS Статья Google ученый

6.

Valadi H, Ekstrom K, Bossios A, Sjostrand M, Lee JJ, Lotvall JO. Опосредованный экзосомами перенос мРНК и микроРНК является новым механизмом генетического обмена между клетками. Nat Cell Biol. 2007; 9: 654–9.

CAS Статья Google ученый

7.

Лин Дж, Ли Дж, Хуан Б., Лю Дж, Чен Х, Чен ХМ, Сюй ЮМ, Хуан Л.Ф., Ван XZ. Экзосомы: новые биомаркеры для клинической диагностики. Научный мир J. 2015; 2015: 657086.

Google ученый

8.

Эйтан Э., Чжан С., Витвер К.В., Маттсон М.П. Обедненные внеклеточными пузырьками сыворотки плода быка и человека обладают пониженной способностью поддерживать рост клеток. J Внеклеточные везикулы. 2015; 4: 26373.

Google ученый

9.

Shelke GV, Lasser C, Gho YS, Lotvall J. Важность протоколов истощения экзосом для устранения функциональных и РНК-содержащих внеклеточных везикул из фетальной бычьей сыворотки. Журнал внеклеточных пузырьков 2014; 3. DOI: 10.3402 / jev.v3.24783.

10.

Бенинсон Л.А., Флешнер М. Экзосомы в фетальной бычьей сыворотке подавляют ответ первичного макрофага IL-1beta на липополисахаридную (LPS) провокацию. Immunol Lett. 2014; 163: 187–92.

Артикул Google ученый

11.

Ochieng J, Pratap S, Khatua AK, Sakwe AM. Независимый от закрепления рост клеток карциномы молочной железы опосредуется экзосомами сыворотки. Exp Cell Res. 2009; 315: 1875–88.

CAS Статья Google ученый

12.

Карадек Дж., Хармат Дж., Хоссейни-Бехешти Э., Адомат Х., Глив М., Ганс Э. Воспроизводимость и эффективность методов экстракции экзосом из сыворотки крови. Clin Biochem. 2014; 47: 1286–92.

CAS Статья Google ученый

13.

Raposo G, Stoorvogel W. Внеклеточные везикулы: экзосомы, микровезикулы и другие. J Cell Biol. 2013; 200: 373–83.

CAS Статья Google ученый

14.

Шерр С.Дж. Циклины D-типа. Trends Biochem Sci. 1995; 20: 187–90.

CAS Статья Google ученый

15.

Rathbone CR, Booth FW, Lees SJ. Sirt1 увеличивает пролиферацию клеток-предшественников скелетных мышц.Eur J Cell Biol. 2009; 88: 35–44.

CAS Статья Google ученый

16.

Надаль-Жинар Б. Приверженность, слияние и биохимическая дифференцировка миогенной клеточной линии в отсутствие синтеза ДНК. Клетка. 1978; 15: 855–64.

CAS Статья Google ученый

17.

Чжан Дж. М., Вэй К., Чжао Х, Патерсон Б. М.. Сцепление клеточного цикла и миогенеза через циклин D1-зависимое взаимодействие MyoD с cdk4.EMBO J. 1999; 18: 926–33.

CAS Статья Google ученый

18.

Кутсулиду А., Мастрояннопулос Н.П., Фурлинг Д., Уней Дж. Б., Филакту Л.А. Экспрессия miR-1, miR-133a, miR-133b и miR-206 увеличивается во время развития скелетных мышц человека. BMC Dev Biol. 2011; 11:34.

CAS Статья Google ученый

19.

Томас М., Лэнгли Б., Берри К., Шарма М., Кирк С., Басс Дж., Камбадур Р.Миостатин. Миостатин, отрицательный регулятор роста мышц, действует путем ингибирования пролиферации миобластов. J Biol Chem. 2000; 275: 40235–43.

20.

Rachagani S, Cheng Y, Reecy JM. Генотип миостатина регулирует мышечно-специфическую экспрессию miRNA в грудной мышце мыши. BMC Res Notes. 2010; 3: 297.

Артикул Google ученый

21.

Cheng CS, El-Abd Y, Bui K, Hyun YE, Hughes RH, Kraus WE, Truskey GA .. Условия, которые способствуют первичной культуре скелетных миобластов человека и дифференцировке мышц in vitro.Am J Physiol. 2014; 306: C385–95.

CAS Статья Google ученый

22.

Сокол Н.С., Амброс В. Мезодермально экспрессируемая микроРНК-1 дрозофилы регулируется Twist и требуется в мышцах во время роста личинок. Genes Dev. 2005; 19: 2343–54.

CAS Статья Google ученый

23.

Кэби М.П., ​​Ланкар Д., Винсендо-Шеррер С., Рапосо Г., Боннеро С. Экзосомоподобные везикулы присутствуют в плазме крови человека.Int Immunol. 2005; 17: 879–87.

CAS Статья Google ученый

24.

Aswad H, Forterre A, Wiklander OP, Vial G, Danty-Berger E, Jalabert A, Lamaziere A, Meugnier E, Pesenti S, Ott C, Chikh K, El-Andaloussi S, Vidal H, Lefai E, Rieusset J, Rome S. Экзосомы участвуют в изменении мышечного гомеостаза во время индуцированной липидами резистентности к инсулину у мышей. Диабетология. 2014; 57: 2155–64.

CAS Статья Google ученый

25.

Forterre A, Jalabert A, Berger E, Baudet M, Chikh K, Errazuriz E, De Larichaudy J, Chanon S, Weiss-Gayet M, Hesse AM, Record M, Geloen A, Lefai E, Vidal H, Coute Y, Rome S .. Протеомный анализ миобластов C2C12 и везикул, подобных экзосомам миотрубок: новая парадигма перекрестного взаимодействия миобластов и миотрубок? PLoS One. 2014; 9: e84153.

Артикул Google ученый

26.

Thery C, Amigorena S, Raposo G, Clayton A. Выделение и характеристика экзосом из супернатантов клеточных культур и биологических жидкостей.Текущие протоколы в клеточной биологии / редколлегия, Juan S. Bonifacino et al. 2006. Глава 3: Раздел 3.22. DOI: 10.1002 / 0471143030.cb0322s30.

27.

Mulcahy LA, Pink RC, Carter DR. Пути и механизмы захвата внеклеточных везикул. Журнал внеклеточных пузырьков 2014; 3. DOI: 10.3402 / jev.v3.24641.

28.

Тиан Т, Ван Й, Ван Х, Чжу З., Сяо З. Визуализация клеточного поглощения и внутриклеточного движения экзосом с помощью микроскопии живых клеток. J Cell Biochem.2010; 111: 488–96.

CAS Статья Google ученый

29.

Сеттембре С., Фральди А., Медина Д.Л., Баллабио А. Сигналы от лизосомы: центр управления клеточным клиренсом и энергетическим метаболизмом. Nat Rev.2013; 14: 283–96.

CAS Статья Google ученый

30.

Borges FT, Melo SA, Ozdemir BC, Kato N, Revuelta I, Miller CA, Gattone VH, 2nd, LeBleu VS, Kalluri R.Экзосомы, содержащие TGF-бета1, из поврежденных эпителиальных клеток активируют фибробласты, чтобы инициировать регенеративные реакции тканей и фиброз. J Am Soc Nephrol. 2013; 24: 385–92.

CAS Статья Google ученый

31.

Szczepanski MJ, Szajnik M, Welsh A, Whiteside TL, Boyiadzis M. Взрывные микровезикулы в сыворотке крови пациентов с острым миелоидным лейкозом подавляют функцию естественных клеток-киллеров через мембранно-связанный трансформирующий фактор роста-бета1.Haematologica. 2010; 96: 1302–9.

Артикул Google ученый

32.

Wada J, Onishi H, Suzuki H, Yamasaki A, Nagai S, Morisaki T., Katano M. Поверхностно связанный TGF-beta1 на экзосомах, полученных из эффузии, участвует в поддержании количества и подавляющей функции регуляторных T- клетки в злокачественных излияниях. Anticancer Res. 2010. 30: 3747–57.

CAS Google ученый

33.

Zhang L, Wrana JL. Возникающая роль экзосом в секреции и транспорте Wnt. Curr Opin Genet Dev. 2014; 27: 14–9.

Артикул Google ученый

34.

Vyas N, Walvekar A, Tate D, Lakshmanan V, Bansal D, Lo Cicero A, Raposo G, Palakodeti D, Dhawan J. Vertebrate Hedgehog секретируется двумя типами внеклеточных пузырьков с разными сигнальными свойствами. Научный отчет 2014; 4: 7357.

CAS Статья Google ученый

35.

DeClercq V, d’Eon B, McLeod RS. Жирные кислоты увеличивают секрецию адипонектина как классическими, так и экзосомными путями. Biochim Biophys Acta. 1851; 2015: 1123–33.

Google ученый

36.

Бак А. Х., Коукли Г., Симбари Ф., МакСорли Х. Дж., Кинтана Дж. Ф., Ле Бихан Т. и др. Экзосомы, секретируемые паразитами-нематодами, переносят малые РНК в клетки млекопитающих и модулируют врожденный иммунитет. Nat Commun. 2014; 5: 5488.

37.

Rieu S, Geminard C, Rabesandratana H, Sainte-Marie J, Vidal M.Экзосомы, высвобождаемые во время созревания ретикулоцитов, связываются с фибронектином через интегрин альфа4бета1. Eur J Biochem. 2000; 267: 583–90.

CAS Статья Google ученый

38.

Forterre A, Jalabert A, Chikh K, Pesenti S, Euthine V, Granjon A, Errazuriz E, Lefai E, Vidal H, Rome S. Экзосомные миРНК, происходящие из миотрубок, подавляют активность Sirtuin1 в миобластах во время дифференцировки мышечных клеток. Клеточный цикл. 2014; 13: 78–89.

CAS Статья Google ученый

39.

EL Andaloussi S, Mager I, Breakefield XO, Wood MJ. Внеклеточные везикулы: биология и новые терапевтические возможности. Nat Rev Drug Discov. 2013; 12: 347–57.

CAS Статья Google ученый

40.

Драгович Р.А., Гардинер С., Брукс А.С., Таннетта Д.С., Фергюсон Д.Д., Хоул П, Карр Б., Редман К.В., Харрис А.Л., Добсон П.Дж., Харрисон П., Сарджент Иллинойс. Определение размеров и фенотипирование клеточных везикул с использованием анализа отслеживания наночастиц.Наномедицина. 2011; 7: 780–8.

CAS Google ученый

41.

Bouzakri K, Roques M, Gual P, Espinosa S, Guebre-Egziabher F, Riou JP, Laville M, Le Marchand-Brustel Y, Tanti JF, Vidal H. Сниженная активация киназы фосфатидилинозитол-3 и повышенная фосфорилирование серина 636 субстрата-1 рецептора инсулина в первичной культуре клеток скелетных мышц пациентов с диабетом 2 типа. Диабет. 2003. 52: 1319–25.

CAS Статья Google ученый

42.

Куа Б.Дж., О’Нил ХК. Загрязняющие микоплазмы, присутствующие в препаратах экзосом, вызывают ответы поликлональных В-клеток. J Leukoc Biol. 2007; 82: 1070–82.

CAS Статья Google ученый

43.

Stern-Straeter J, Bonaterra GA, Zugel S, Kassner SS, Hormann K, Kinscherf R, Goessler UR. Оценка действительных эталонных генов во время стимуляции статическими магнитными полями в культурах миобластов человека. Мол Мед Реп. 2009; 3: 237–43.

Google ученый

44.

Hildyard JC, Wells DJ. Идентификация и проверка количественных эталонных генов ПЦР, подходящих для нормализации экспрессии в моделях миогенеза нормальных и дистрофических клеточных культур. PLoS токи 2014; 6. doi: 10.1371 / currents.md.faafdde4bea8df4aa7d06cd5553119a6.

Профилирование активности хемоаттрактанта нервного гребня человека в качестве замены фетальной бычьей сыворотки для анализов хемотаксиса in vitro

Введение

Направленная миграция клеток нервного гребня (NCC) на большие расстояния важна для нормального развития позвоночных.Генетические дефекты, мешающие этому процессу, могут привести к широкому спектру пороков развития и синдромов заболеваний, таких как болезнь Гиршпрунга, синдром Тричера Коллинза или синдром Ваарденбурга (Vega-Lopez et al., 2018; Serrano et al., 2019). Химические вещества, которые препятствуют миграции NCC, часто приводят к черепно-лицевым дефектам у развивающегося плода (Zhang et al., 2017). Это хорошо задокументировано для этанола или пестицидов, таких как триадимефон (Menegola et al., 2005). Нарушенные уровни ретиноевой кислоты (RA) являются важной причиной нарушения миграции и дифференцировки NCC.В таких условиях черепно-лицевые дефекты наблюдаются как у животных, так и у человека (Williams, Bohnsack, 2019).

NCC представляют собой мультипотентные клетки, образующиеся на боковых краях нервной пластинки. Во время раннего развития плода NCC мигрируют на большие расстояния к своим целевым участкам, таким как кожа, череп и кишечник. Они дифференцируются в большое количество типов клеток, включая нейроны, меланоциты и хондроциты (Le Douarin, 2004). NCC сгруппированы в субпопуляции в соответствии с их положением в переднезадней оси эмбриона.Черепные NCC строят в основном структуры головы (Prasad et al., 2019), сердечные NCC вносят вклад в гладкую мускулатуру большого сосуда / аорты (Sieber-Blum, 2004), а стволовые NCC дают начало сенсорным нейронам, симпатоадреналовой системе. и пигментные клетки (Giovannone et al., 2015; Huang et al., 2016).

Миграция клеток — сложный процесс, включающий несколько биологических функций, например адгезия клеток к внеклеточному матриксу (ЕСМ), отслоение от субстрата и ремоделирование цитоскелета.Во время процесса миграции выступы расширяются на переднем крае, тогда как задний край сокращается, и клеточный материал перемещается к переднему полюсу клетки (Conway and Jacquemet, 2019; Ridley et al., 2003). Процесс, посредством которого факторы способствуют увеличению подвижности клеток, называется хемокинезом, тогда как хемотаксис определяется как управляемое движение клеток по градиенту связанных молекул, растворимых факторов или механических стимулов (Shellard and Mayor, 2016). Для выполнения хемотаксиса клетки должны иметь повышенную подвижность, но также проявлять такие свойства, как определение направления и поддержание полярности (Kay et al., 2008). Поляризованные клетки определяются передней частью, которая имеет локализованную полимеризацию актина, и задней частью, которая способна сокращаться (Kay et al., 2008). Направленное зондирование — это свойство клеток сравнивать занятость рецепторов по их поверхности и определять, где концентрация является максимальной (Kay et al., 2008). В присутствии градиента хемоаттрактанта клетки чувствуют градиент, выравнивают свою полярность с ним и, наконец, мигрируют по градиенту (Wu, 2005).

Миграция NCC инициируется процессом, называемым эпителиально-мезенхимальным переходом (EMT), который сопровождается несколькими увеличивающими подвижность изменениями, которые влияют на полярность клеток и адгезивные свойства (Nieto et al., 2016). Хемотаксис наблюдался для отдельных NCC, но также и для групп клеток, движущихся скоординированным образом, например дикие гуси (Capuana et al., 2020). Коллективная миграция позволяет кластеру NCC мигрировать быстрее и следовать слабому градиенту хемоаттрактанта, к которому одна клетка будет нечувствительна (Merchant and Feng, 2020; Mayor and Etienne-Manneville, 2016). Кластер мигрирующих клеток определяется ведущими и ведомыми клетками, которые различаются по экспрессии генов (Capuana et al., 2020). Паттерны транскриптома, контролирующие такое поведение, зависят от местной среды и экспериментальных систем (McLennan et al., 2015), и вполне вероятно, что хемотактически активные NCC отличаются от клеток, не следующих по градиенту.

В отношении хемоаттрактантов NCC были предложены различные факторы, например фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) для черепных NCC кур (McLennan et al., 2010) и фактор роста тромбоцитов (PDGF) в черепных NCC рыбок данио (Eberhart et al., 2008), факторы роста фибробластов (FGF) в краниальной, сердечной и туловищной областях мышей (Kubota and Ito, 2000) и фактор 1, полученный из стромальных клеток (SDF-1 / CXCL12), в краниальной и туловищной областях курицы ( Kasemeier-Kulesa et al., 2010). Текущие знания о развитии NCC в основном получены на животных моделях. Наиболее распространенные эксперименты in vivo или in vitro по изучению миграции и хемотаксиса NCC были выполнены с использованием NCC Xenopus laevis , мыши, крысы и цыплят (Bahm et al., 2017; Theveneau et al., 2010; МакЛеннан и др., 2010; Кубота и Ито, 2000). Таким образом, большинство из вышеупомянутых хемоаттрактантов не подтверждено для человеческих NCC. Использование человеческих NCC, дифференцированных от плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSC), постепенно становится привлекательным в этой области, и доступно несколько протоколов дифференцировки (Hackland et al., 2017; Hackland et al., 2019; Tchieu et al., 2017; Zimmer et al. ., 2012; Chambers et al., 2016). Эти протоколы дифференцировки in vitro и дали новое понимание молекулярных механизмов развития НК человека.Использование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) от пациентов позволило моделировать нейрокристопатии (Srinivasan and Toh, 2019; Workman et al., 2017; Lee et al., 2009; Zeltner et al., 2016). Более того, экспериментальные модели, основанные на человеческих NCC, помогли идентифицировать химические вещества, которые ингибируют миграцию (Zimmer et al., 2012; Nyffeler et al., 2017a). К сожалению, данные о стойких, зависимых от концентрации стимулах хемотаксиса все еще отсутствуют. Такой стимул может потребоваться для проверки того, могут ли химические вещества конкретно нарушать направленную миграцию.

В настоящее время в торговле используются тысячи непроверенных химических веществ, и оценка всех их потенциально вредных свойств на сложных моделях животных невозможна. Из-за потенциальных различий между видами необходимы методы высокопроизводительного скрининга (HTS) на основе клеток человека (Hartung, 2009; Hartung and Leist, 2008; Collins et al., 2008). Такие новые методы подхода (NAM) должны обеспечивать дешевое и быстрое тестирование многих химических веществ (Crofton et al., 2012; Aschner et al., 2017; Bal-Price et al., 2018; Кребс и др., 2020; Смирнова и др., 2014). Анализ хемотаксиса NCC можно включить в батарею тестов NAM (Zimmer et al., 2014) и использовать в контексте оценки риска следующего поколения (NGRA) (Baltazar et al., 2020; Vinken et al., 2021). На основании этого может быть проведена оценка риска для безопасности соединений без содержания животных (Moné et al., 2020).

Действительно, за последние десять лет было разработано несколько анализов in vitro для исследования миграции NCC, основанных на человеческих NCC, дифференцированных от hPSC (Lee et al., 2010; Zimmer et al., 2012). В исходном анализе заживления ран в монослой NCC вводили царапину, чтобы создать бесклеточную область. Было идентифицировано множество токсичных веществ, мешающих перемещению клеток в промежуток, и анализ ингибирования циркулярной миграции клеток нервного гребня (cMINC) является улучшенной версией (надежность и пропускная способность) исходного анализа царапин. Как и в исходном анализе заживления ран, NCC случайным образом мигрируют в бесклеточную зону (Nyffeler et al., 2017b; Nyffeler et al., 2017а). Подтверждены известные токсиканты NCC (включая вальпроевую кислоту (VPA), хлорид метилртути, As2O3, CdCl2 и полихлорированные бифенилы (ПХБ)), а также выявлено несколько неизвестных опасных химических веществ (Dreser et al., 2015; Zimmer et al., 2012; Zimmer et al., 2014; Nyffeler et al., 2017b; Nyffeler et al., 2018).

Вышеупомянутые анализы моделируют миграцию NCC, но они не могут оценить направленную миграцию клеток. Анализы хемотаксиса требуют стабильного градиента хемоаттрактанта, который может ощущаться клетками (Shellard and Mayor, 2016).Для построения такого градиента существует острая потребность в хемоаттрактанте NCC человека. Насколько нам известно, бычья сыворотка — единственный известный стимул моторики, описанный в литературе. Из-за своего животного происхождения и плохо стандартизованного состава он не является идеальной основой для постановки анализа.

Таким образом, целью данного исследования было выявление более определенных хемоаттрактантов для изучения направленной миграции NCC. Целью исследования было проверить, действительно ли FBS запускает хемотаксис, а не только хемокинез.Были использованы дополнительные подходы, чтобы продемонстрировать, что белковый фактор отвечает за хемотаксическую активность FBS. Основываясь на этих знаниях, линии клеток человека были проверены на их способность секретировать такой фактор, и клетки HepG2 были найдены в качестве подходящего источника. В качестве альтернативы рассматривали чистый человеческий исходный материал, лизаты тромбоцитов. Было обнаружено, что они содержат мощный хемоаттрактант NCC, который в ходе исследования был сильно обогащен.

Материалы и методы

Дифференцировка клеток нервного гребня

NCC были дифференцированы из линии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) IMR90_clone_ # 4 (WiCell, Madison, Wisconsin, USA) в соответствии с модифицированным протоколом Mica et al.(2013). IPSC поддерживали на покрытии человеческого Laminin-521 (BioLamina, Sundbyger, Швеция) в среде Essential 8 (E8) (DMEM / F12 с добавлением 15 мМ Hepes (Gibco / Fisher Scientific, Хэмптон, Нью-Гэмпшир, США), 16 мг / мл. , L-аскорбиновая кислота, 0,7 мг / мл селенита натрия, 20 мкг / мл инсулина, 10 мкг / мл голо-трансферрина (все от Sigma, Steinheim, Германия), 100 нг / мл bFGF (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts , США), 1,74 нг / мл TGFb (R&D Systems, Миннеаполис, Миннесота, США). Для дифференциации в NCC ИПСК высевали на покрытые Matrigel ^TM (Corning, Glendale, Аризона, США) 6-луночные планшеты с плотностью 100000 клеток / см ² в среде E8, содержащей 10 мкМ ROCK-ингибитор (Y-27632 (Tocris, Бристоль, Великобритания)).Через один день клетки достигли конфлюэнтности 70-80%, и дифференцировка началась (день 0) путем замены среды на среду KSR (нокаут DMEM, 15% нокаутная замена сыворотки, 1% GlutaMax, 1% раствор MEM NEAA, 50 мкМ 2-меркаптоэтанола (все от Gibco / Fisher Scientific, Хэмптон, Нью-Гэмпшир, США) с добавлением 20 нг / мл Noggin (R&D Systems, Миннеаполис, Миннесота, США) и 10 мкМ SB431542 (Токрис, Бристоль, Великобритания). Начиная со 2-го дня клетки обрабатывали 3 мкМ CHIR 99021 (Axon Medchem, Рестон, Вирджиния, США).Noggin и SB431542 были исключены на 3 и 4 день соответственно. Начиная с 4-го дня, среду KSR постепенно заменяли 25% -ными порциями среды N2-S (DMEM / F12, 1% GlutaMax (оба от Gibco / Fisher Scientific, Хэмптон, Нью-Гэмпшир, США), 1,55 мг / мл глюкозы, 0,1 мг / мл апотрансферина, 25 мкг / мл инсулина, 20 нМ прогестерона, 100 мкМ путресцина, 30 нМ селена (все от Sigma, Steinheim, Германия)). Клетки собирали на 11 день, ресуспендировали в среде N2-S с добавлением 20 нг / мл EGF и 20 нг / мл FGF2 (оба от R&D Systems, Миннеаполис, США) и высевали в виде капель (10 мкл) на поли-L- орнитин (PLO) / ламинин / фибронектин (все от Sigma, Steinheim, Германия) покрывали 10-сантиметровые чашки.Клетки расширяли еженедельным разделением. Отныне посев по каплям не требовался, а среду меняли через день. Через 35-39 дней клетки криоконсервировали при концентрации 4 * 10 ⁶ клеток / мл в 90% среде N2-S и 10% диметилсульфоксиде (ДМСО) (Merck Millipore, Берлингтон, Массачусетс, США) до дальнейшего использования. .

Анализ миграции (cMINC)

Анализ ингибирования циркулярной миграции клеток нервного гребня (MINC) выполняли, как описано ранее (Nyffeler et al., 2017б). Вкратце, силиконовые пробки (Platypus Technologies, Мэдисон, Висконсин, США) помещали по центру в каждую экспериментальную лунку 96-луночного планшета из полистирола (Corning, Глендейл, Аризона, США), покрытого 1 мкг / мл фибронектина и 1 мкг / мл ламинина. (оба от Sigma, Штайнхайм, Германия). Клетки засевали вокруг пробок с плотностью 95000 клеток / см ² . На следующий день пробки удаляли, чтобы клетки могли мигрировать в бесклеточную центральную область, и среду обновляли. Чтобы проверить влияние токсикантов на подвижность NCC, в среду добавляли 5-кратный концентрированный раствор токсиканта через 24 часа после снятия пробки.Еще через 24 часа отслеживали жизнеспособность клеток и конечные точки миграции. Для этого клетки окрашивали HOECHST-33342 и кальцеином-AM (оба от Sigma, Steinheim, Германия), и получение изображений выполняли с использованием микроскопа для визуализации Cellomics ArrayScan VTI (Thermo Fisher, Питтсбург, Пенсильвания, США). HOECHST-33342 и двойные положительные по кальцеину клетки были определены как жизнеспособные клетки и определены с помощью автоматизированного алгоритма, описанного ранее (Stiegler et al., 2011; Krug et al., 2013). Для количественной оценки миграции бесплатный программный инструмент (http: // invitrotox.uni-konstanz.de/RA/), как описано в Nyffeler et al. (2017b), чтобы рассчитать исходное положение стопора и определить количество клеток HOECHST-33342 и двойных положительных по кальцеину клеток в зоне миграции. Жизнеспособность и миграция были нормализованы к необработанному контролю или контролю растворителем (0,1% ДМСО).

Анализ мембранной транслокации нервного гребня (NC-MT)

Для анализа NC-MT используются хорошо проницаемые носители Transwell® 24 (размер пор 8 мкм, поликарбонатная мембрана, Corning, Glendale, Arizona, USA, каталожный номер.3422). NCC высевали с плотностью 50 000 клеток на вставку (150 000 клеток / см ² , 100 мкл) в среду N2-S с добавлением 20 нг / мл EGF и 20 нг / мл FGF2 (оба от R&D Systems, Миннеаполис). , Миннесота, США) в верхнюю камеру. Тестируемые соединения добавляли в указанной концентрации в нижнюю камеру (650 мкл). Клеткам позволяли мигрировать в течение 6 часов при 37 ° C и 5% CO2. После инкубации среду отсасывали из вставок и резервуаров, и верхнюю сторону каждой вставки осторожно протирали ватными тампонами для удаления клеток, которые не мигрировали через мембрану.Резервуары и вставки промывали один раз фосфатно-солевым буфером (PBS), а затем мигрировавшие клетки на мембране фиксировали 3,7% формальдегидом (об. / Об. В h3O) и окрашивали кристаллическим фиолетовым в течение 15 мин. Затем вставки тщательно промывали водой и сушили не менее 24 ч. С помощью микроскопа Axio Observer Z1 (Zeiss, Оберкохен, Германия) было сделано пять снимков для каждого условия для оценки количества мигрировавших клеток. Количество мигрировавших клеток было нормализовано к количеству клеток, стимулированных FBS.

Для анализа NC-MT-HTS использовалась высокопроизводительная система скрининга Transwell® (размер пор 8 мкм, полиэфирная мембрана, Corning, Glendale, Arizona, USA, номер по каталогу 3384). Он состоит из 96 лунок проницаемых вставок, соединенных жестким лотком и 96-луночным приемным планшетом. Клетки высевали с плотностью 25000 клеток на вставку (175000 клеток / см ² , 50 мкл) в верхнюю камеру. Тестируемые соединения добавляли в указанной концентрации в нижнюю камеру (150 мкл). Клеткам позволяли мигрировать в течение 6 часов при 37 ° C и 5% CO2.После инкубации среду отсасывали из вкладышей и резервуаров и оба раза промывали PBS. Резервуары заполняли 150 мкл раствора EDTA, содержащего кальцеин-AM (Sigma, Steinheim, Германия), и инкубировали в течение 30 минут при 37 ° C и 5% CO2. Затем планшеты центрифугировали в течение 4 минут при 350 g для удаления мигрировавших клеток с мембраны. Поднос с 96 лунками проницаемых вставок удаляли, а приемный планшет, содержащий мигрировавшие клетки, помещали в спектрофотометр (TECAN, Männedorf, Швейцария).Окрашивание кальцеином-AM было обнаружено при длине эмиссии 520 нм. После вычитания пустых значений количество мигрировавших клеток нормализовали к количеству клеток, стимулированных FBS.

Определение хемотаксического поведения путем отслеживания клеток

Анализ хемотаксиса µ-слайда (Ibidi, Martinsried, Германия) позволяет установить стабильный градиент и наблюдать клетки в этом градиенте с помощью покадровой визуализации. Два резервуара, заполненные хемоаттрактантом или средой, соединены зазором.Промежуток покрывали 1 мкг / мл фибронектина (Sigma, Steinheim, Германия) за день до посева клеток. Промежуток заполняли 6 мкл клеточной суспензии с концентрацией 3 × 10 ⁶ клеток / мл (= 18000 клеток). Клеткам давали возможность прикрепиться в течение 3 часов при 37 ° C и 5% CO2. После этого резервуары заполняли чистой средой с одной стороны и средой, содержащей хемоаттрактант, с другой стороны. Сразу после этого слайд хемотаксиса µ-слайда помещали на предметный столик микроскопа Axio Observer Z1 (Zeiss, Оберкохен, Германия), оборудованного камерой Axiocam MRm и инкубационной камерой (37 ° C, 5% CO2).Фазово-контрастные изображения получали в течение 24 часов каждые 10 минут с использованием 5-кратного объектива. Изображения были экспортированы в виде файлов JPEG, а отслеживание ячеек выполнялось с помощью подключаемого модуля «Manual Tracking» от ImageJ (Schneider et al., 2012). Для каждого биологического повтора отслеживали 20 клеток на каждое условие. Полученные координаты клеток были переданы в «Инструмент хемотаксиса и миграции V2.0» (Ibidi, Martinsried, Германия) для определения транслокации клеток, накопленного расстояния и скорости клеток, а также для создания «диаграмм роста» отслеживаемых клеток.

Совместное культивирование и приготовление кондиционированной среды

Клетки гепатомы HepG2 (ATCC, HB-8065), клетки карциномы молочной железы MDA-MB-231 (ATCC, HTB-26), клетки рака шейки матки HeLa (ATCC, CCL-2), Эмбриональные клетки почки человека HEK-239 (ATCC, CRL-1573) и клетки нейробластомы SH-SY5Y (ATCC, CRL-2266) культивировали в DMEM + GlutMax ^TM (Gibco / Fisher Scientific, Хэмптон, Нью-Гэмпшир, США) с добавками с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) (PAA Laboratories, Pasching, Австрия) и 1% pen / strep (Gibco / Fisher Scientific, Хэмптон, Нью-Гэмпшир, США) при 37 ° C и 5% CO2.Клетки пассировали через день.

Для приготовления кондиционированной среды (CM) клетки высевали в DMEM + GlutMax ^TM (Gibco / Fisher Scientific, Хэмптон, Нью-Гэмпшир, США) с добавлением 10% FBS (PAA Laboratories, Пашинг, Австрия) и 1% pen / strep (Gibco / Fisher Scientific, Хэмптон, Нью-Гэмпшир, США) и выращивали до слияния. Затем среду аспирировали, клетки промывали один раз фосфатно-солевым буфером (PBS), а затем добавляли свежий DMEM + GlutMax ^TM (Gibco / Fisher Scientific, Хэмптон, Нью-Гэмпшир, США) без FBS и pen / strep.Клетки инкубировали 24 ч. Для удаления любых остатков FBS среду снова аспирировали, клетки один раз промывали PBS, а затем добавляли свежую DMEM + GlutMax ^TM (Gibco / Fisher Scientific, Хэмптон, Нью-Гэмпшир, США). После инкубации в течение еще 24 часов супернатант среды собирали и центрифугировали при 314 x g в течение 4 минут для удаления остатков клеток. Эту кондиционированную среду (CM) либо использовали в анализе через лунки, либо дополнительно обрабатывали осаждением ацетоном (осадок хранили при -20 ° C).

Для экспериментов по совместному культивированию клетки высевали при концентрации 150 000 клеток / см ² в 24-луночные планшеты в DMEM + GlutMax ^TM (Gibco / Fisher Scientific, Хэмптон, Нью-Гэмпшир, США) с добавками с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) (PAA Laboratories, Pasching, Австрия) и 1% pen / strep (Gibco / Fisher Scientific, Хэмптон, Нью-Гэмпшир, США). Клетки инкубировали 24 ч. После этого клетки один раз промывали фосфатно-солевым буфером (PBS), а затем добавляли свежий DMEM + GlutMax ^TM (Gibco / Fisher Scientific, Хэмптон, Нью-Гэмпшир, США).Этапы были аналогичны приготовлению кондиционированной среды. После 48 ч голодания вставки трансвелл с засеянными NCC помещали в лунки 24-луночного планшета, содержащего голодные клетки.

Препарат сыворотки крови человека и лизата тромбоцитов

Подход 1 (сыворотка человека). Цельную кровь получали от здоровых взрослых добровольцев и собирали в Monovettes (7,5 мл, K3 EDTA, Sarstedt, Nümbrecht, Германия). Процедуры были одобрены институциональным наблюдательным советом (IRB) Университета Констанца.Перед сбором крови моноветки дважды промывали водой MilliQ для удаления ЭДТА и обеспечения свертывания. Для приготовления сыворотки цельной крови давали возможность свернуться, оставляя ее в покое при комнатной температуре в течение 30 минут. Сгусток удаляли центрифугированием при 1500 x g в течение 10 мин при 4 ° C. Супернатанты немедленно переносили в свежие пробирки, разделяли на аликвоты и хранили при -80 ° C.

Подход 2 (препарат huPL): Для приготовления лизата тромбоцитов цельную кровь центрифугировали при 150 g в течение 20 мин при комнатной температуре для сбора богатой тромбоцитами плазмы.Только верхняя половина богатой тромбоцитами плазмы была перенесена в новую пластиковую пробирку и буфер А (10 мМ цитрат натрия, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1% декстроза, pH 7,4), содержащий 1 мкМ простагландина (PGI2, Iloprost, Sigma , Steinheim, Германия) добавляли в соотношении 1: 1. Смесь центрифугировали при 350 g в течение 15 мин при комнатной температуре. Осадок тромбоцитов промывали один раз в буфере B (140 мМ NaCl, 6 мМ KCl, 2 мМ Mg2SO4, 2 мМ NaHPO4, 6 мМ HEPES, pH 7,4) для удаления остатков плазмы. Осадок ресуспендировали в соответствующем объеме буфера B, и тромбоциты лизировали с помощью трех циклов замораживания-оттаивания при -20 ° C и 37 ° C.Наконец, лизат тромбоцитов центрифугировали при 2000 x g в течение 15 мин при комнатной температуре для удаления остатков тромбоцитов. Супернатант разделяли на аликвоты и хранили при -20 ° C.

Подход 3: коммерческие huPL (исследование CRUX RUFA (Trinova Biochem, Гиссен, Германия), ELAREM ™ PRIME (PL BioScience, Аахен, Германия), Stemulate ™ (COOK Regentec, Индианаполис, Индиана, США)) были получены, разделены на аликвоты и хранить при -20 ° C. Чтобы предотвратить коагуляцию среды для культивирования клеток, добавляли гепарин (PL-HEP-0005) до конечной концентрации 2 Ед / мл.При использовании Stemulate ™ (COOK Regentec, Индианаполис, Индиана, США) гепарин не требовался.

Осаждение ацетоном

FBS, huPL или HepG2 CM смешивали с 30% предварительно охлажденным ацетоном (VWR Chemicals, Дармштадт, Германия) и инкубировали в течение ночи при -20 ° C. Затем образцы центрифугировали при 7000 x g в течение 30 мин. После этого супернатант переносили в новую центрифужную пробирку на 250 мл (Corning, Glendale, Arizona, USA) и осадок отбрасывали. Затем добавляли 10% предварительно охлажденный ацетон (VWR Chemicals, Дармштадт, Германия) и снова инкубировали в течение ночи при -20 ° C.Образец центрифугировали при 7000 g в течение 30 мин. На этот раз супернатант сливали, а оставшийся осадок сушили при комнатной температуре до испарения остатков ацетона. Гранулы хранили при -20 ° C для дальнейшего использования.

Очистка белков

Быстрая жидкостная хроматография белков (FPLC) была использована для очистки сложных белковых смесей. В этой процедуре используется тот факт, что разные белки имеют разное сродство к смоле очистительных колонок.FPLC выполняли с использованием системы ÄKTAprime plus (GE Healthcare, Мюнхен, Германия), оснащенной системой обнаружения УФ-излучения. Разделение белков проводили с помощью различных ионообменных колонок: катионообменной колонки (HiScreen Capto SP ImpRes, GE Healthcare, Мюнхен, Германия), анионообменной колонки (HiTrap Q HP 1 мл, GE Healthcare) и другой анионообменной колонки (HiTrap Q FF 5 мл, GE Healthcare, Мюнхен, Германия). Стартовый буфер содержал 10 мМ Трис-HCl (pH 7,4), а буферы для элюирования дополнительно содержали 2 М MgCl2 для катионообменной колонки или 2 М NaCl для анионообменных колонок.Все буферы перед использованием подвергали стерильной фильтрации. Хроматографическое разделение выполняли с использованием линейного градиента буфера для элюирования, начиная от 0 до 50%, с последующим шагом до 100% ( Рисунок S5 ). Перед загрузкой в ​​колонку образец белка стерильно фильтровали. Разделение FPLC проводили при комнатной температуре (RT), и фракции объемом 1 мл разделяли с помощью коллектора фракций. В рамках процесса ступенчатой ​​очистки собранные фракции были протестированы на биологическую активность в анализе NC-MT.Для этого фракции разбавляли средой 1 + 4 и тестировали активность, увеличивающую миграцию. Для дальнейших стадий очистки активные фракции объединяли и обессоливали с помощью обессоливающей колонки (HiPrep 26/10 Desalting, GE Healthcare, Мюнхен, Германия), используя воду MilliQ в качестве буфера для элюирования. После этого обессоленный образец загружали во вторую ионообменную колонку для дальнейшего разделения белков. Отдельные фракции тестировали в анализе NC-MT на их активность, увеличивающую миграцию.

Разделение и обнаружение белков

Для электрофореза в полиакриламидном геле (PAGE) образцы лизировали в 1x буфере Лэммли и кипятили в течение 5 минут при 95 ° C. Тридцать пять микрограммов общего белка загружали в 10% гели PAA. Затем гель окрашивали красителем кумасси синим (InstantBlue, VWR Chemicals, Дармштадт, Германия) в течение 20 мин или в течение ночи, а затем дважды промывали обессоленной водой. Окрашивание серебром выполняли в соответствии с инструкцией к набору Pierce ™ Silver Stain для масс-спектрометрии (Pierce / Thermo Fisher Scientific, Рокфорд, Иллинойс, США, каталог No.24600).

Для вестерн-блоттинга образцы лизировали в 1x буфере Лэммли и кипятили в течение 5 минут при 95 ° C. Тридцать пять микрограммов общего белка загружали в 10% гели PAA. После этого белки переносили на нитроцеллюлозные мембраны (Amersham, Buckinghamshire, UK) с помощью системы Invitrogen iBlot 2. Мембраны блокировали 5% сухим молоком (вес / объем) в 0,1% TBS-Tween (об / об) в течение по меньшей мере 1 часа. Инкубировали антитело к фибронектину ab45688 (Abcam, Кембридж, Великобритания), антитело к альфа-1-фетопротеину (AFP) ab133617 (Abcam, Cambridge, UK) и антитело к глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназе (GAPDH) ZG003 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, США). при 4 ° C в течение ночи.После стадий промывания 0,1% TBS-Tween (об. / Об.), Вторичных антител (конъюгированных с пероксидазой козьих антимышиных IgG AffiniPure (Jackson Immunoresearch, Кембридж, Великобритания) или конъюгированных с пероксидазой хрена ослов против кроличьих IgG (GE Healthcare, München) , Германия)) инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Для визуализации использовали субстрат для вестерн-блоттинга ECL (Pierce / Thermo Fisher Scientific, Рокфорд, Иллинойс, США).

Для количественного определения белка использовали набор для анализа белка Quick Start ^TM Bradford (Bio Rad, München, Germany), и анализ выполняли в соответствии с инструкциями производителя.BSA использовали в качестве стандарта белка с концентрациями от 2 мг / мл до 1,25 мкг / мл. Анализ проводили в 96-луночном планшете, и стандартные разведения BSA и разведения образцов добавляли в лунки в трех экземплярах, соответственно. После инкубации в течение 5 минут при комнатной температуре оптическую плотность измеряли при 595 нм с помощью спектрофотометра (TECAN, Männedorf, Швейцария).

Масс-спектрометрия (МС) для идентификации белков

Активные фракции из анализа NC-MT были разделены в 10% геле SDS и окрашены кумасси синим (InstantBlue, VWR Chemicals, Дармштадт, Германия) или набором для окрашивания серебром для определения массы. спектрометрия (Pierce / Thermo Fisher Scientific, Рокфорд, Иллинойс, США, каталог №24600). Представляющие интерес белковые полосы были вырезаны, и все дальнейшие шаги были выполнены в Центре протеомики Университета Констанца.

Для подготовки образцов все образцы восстанавливали DTT (30 мин, 56 ° C) и алкилировали хлорацетамидом (60 мин, КТ). Расщепление проводили с использованием трипсина (16 ч, 30 ° C).

Все гидролизаты анализировали на масс-спектрометре QExactive HF (Thermo Fisher Scientific, Бремен, Германия), сопряженном с системой жидкостной хроматографии Easy-nLC 1200 nanoflow (Thermo Fisher Scientific, Бремен, Германия).Пептидные гидролизаты восстанавливали в 0,1% муравьиной кислоте и загружали в аналитическую колонку (75 мкм × 15 см). Пептиды разделяли при скорости потока 300 нл / мин с использованием линейного градиента 6-45% растворителя B (0,1% муравьиной кислоты в 80% ацетонитриле) в течение 45 минут. Сбор данных в зависимости от данных с полным сканированием в диапазоне 350-1500 m / z проводился с разрешением по массам 120 000. Для фрагментации были выбраны 15 наиболее интенсивных ионов-прекурсоров. Были выбраны пептиды с зарядовыми состояниями 2-7, и динамическое исключение было установлено на 30 секунд.Ионы-предшественники были фрагментированы с использованием диссоциации при столкновении с более высокой энергией (HCD), установленной на 28%. Для оценки данных необработанные данные сравнивали с подходящей базой данных с помощью Proteome Discoverer 1.4 (Thermo Scientific).

Тепловая инактивация и расщепление пепсином

Образцы FBS, huPL и HepG2 CM подвергали термообработке в различных условиях. Поэтому образцы инкубировали в тепловых блоках с температурами 60 и 70 ° C в течение 30 минут и в тепловых блоках с температурами 80 и 90 ° C в течение 15 минут.

Для расщепления пепсином образцы FBS, huPL и HepG2 CM смешивали с раствором пепсина, в результате чего конечная концентрация пепсина составляла 0,5% (мас. / Об.). PH доводили до pH = 2 с помощью 1 M раствора HCl и контролировали с помощью полосок pH. Образцы инкубировали при 37 ° C на водяной бане. После 1 ч инкубации pH образца доводили до pH = 7, добавляя 1 M раствор NaOH, чтобы остановить реакцию пепсина. Контрольный образец подвергали той же процедуре подкисления-инкубации, но без пепсина.Для каждого условия готовили контрольные образцы, чтобы исключить влияние изменения pH на активность образца.

Тесты контроля стабильности

Собранные фракции после ионообменной хроматографии были протестированы непосредственно в анализе NC-MT на их активность, повышающую миграцию. После этого оставшиеся фракции хранили в течение 24 часов в различных условиях: образцы оставляли при 4 ° C или замораживали при -80 ° C, образцы смешивали с 1 мМ ингибитором протеазы (cOmplete tablet, Roche, Базель, Швейцария) и хранили при 4 ° C, образцы подвергали шоковой заморозке в жидком азоте и хранили при -80 ° C, образцы смешивали с 0.5% BSA и хранили при 4 ° C и -80 ° C, а образцы смешивали с 20% глицерином и хранили при -80 ° C. После 24 ч инкубации образцы повторно тестировали в анализе NC-MT на их активность, повышающую миграцию.

Фракционирование белков в соответствии с их молекулярной массой

Центробежные фильтрующие устройства (Amicon®- Ultra-0.5, Merck Millipore, Берлингтон, Массачусетс, США) пяти различных размеров отсечки (3 K, 10 K, 30 K , 50 K, 100 K; K = 1000 Da) заполняли 500 мкл образца и центрифугировали в течение 15 минут при 14000 xg при комнатной температуре.Пробирка для сбора (фильтрат) содержала белки меньшего размера, чем предел молекулярной границы. Белки крупнее порогового значения оставались после центрифугирования в фильтрующем устройстве (супернатант). Чтобы собрать образец в фильтрующем устройстве, его поместили вверх дном в пустую пробирку и центрифугировали в течение двух минут при 1000 x g при комнатной температуре.

Обработка данных и статистика

Если не указано иное, значения выражены как средние значения по крайней мере трех различных экспериментов (т. Е. С использованием трех разных препаратов клеток), по крайней мере с тремя техническими повторностями на препарат клеток.Статистические различия проверяли с помощью дисперсионного анализа (ANOVA) с апостериорными тестами, если это необходимо, с использованием GraphPad Prism 7.0 (Graphpad Software, La Jolla, США, www.graphpad.com).

Результаты и обсуждение

Создание анализа хемотаксиса на основе человеческих NCC

FBS, как было показано ранее, ускоряет мобильность NCC (Nyffeler et al., 2017b), и поэтому он был использован здесь как многообещающий первый кандидат для установить градиент хемоаттрактанта для анализа хемотаксиса. В качестве принципа анализа мы использовали модифицированный подход камеры Бойдена (Boyden, 1962; Mastyugin et al., 2004). Более того, ранее было доказано, что эта установка полезна для изучения ингибирования движения NCC тестируемыми химическими веществами (Nyffeler et al., 2017a; Nyffeler et al., 2018). В качестве источника клеток мы использовали NCC, дифференцированные от плюрипотентных стволовых клеток. Такие клетки были охарактеризованы всесторонним анализом транскриптомов, и они успешно использовались в качестве тест-системы для in vitro анализов (Nyffeler et al., 2017a; Pallocca et al., 2017; Zimmer et al., 2014; Klose et al. ., 2021; Ли и др., 2010).

Основным преимуществом нашего анализа является то, что клетки (NCC) культивируются на поверхности пористой мембраны в верхнем отделении двухкамерной системы, и миграция клеток через мембрану в нижнюю камеру может быть легко определена количественно. По этой причине мы назвали наш тест анализом «транслокация нервного гребня-мембрана» (NC-MT). В этой системе градиент хемоаттрактанта может быть установлен через мембрану путем добавления различных концентраций хемоаттрактанта в верхнюю и нижнюю камеру (, рис. 1А, ).Было показано, что клетки остаются на (нижней поверхности) мембраны после миграции. Таким образом, количественная оценка миграции была очень простой: клетки окрашивали и подсчитывали в конце периода миграции (6 ч) ( Рисунок 1B ). Чтобы убедиться, что FBS запускает истинный хемотаксис, сравнивали различные экспериментальные условия. Клетки мигрировали только тогда, когда был установлен градиент через мембрану, и они ощущали более высокую концентрацию FBS в нижнем отделении.Прямой контакт клеток с высокими концентрациями FBS в верхнем отсеке не запускал миграцию через мембрану в нижний отсек. Таким образом, мы заключаем, что анализ оценивает подлинный хемотаксис ( Рисунок 1C ). В этой установке были протестированы многие хемоаттрактанты NCC, известные из исследований клеток животных. Ни один из них не показал хемотаксического действия на человеческие NCC в анализе NC-MT ( Рисунок 1D ). Используя тот же анализ, мы обнаружили активность, запускающую хемотаксис (CTA) в сыворотке крови человека (huSerum), которая была аналогична таковой в FBS.Таким образом, человеческая сыворотка также содержит хемоаттрактант NCC и может использоваться для настройки анализа (, рис. 1D, ).

Рисунок 1: Характеристика фактора, способствующего хемотаксису, бычьей сыворотки.

(A) Графическое представление принципа анализа транслокации нервного гребня через мембрану (NC-MT). Клетки помещали во вкладыши для клеточных культур, снабженные пористой мембраной внизу. Это позволяет добавлять различные количества потенциальных хемоаттрактантов в резервуар и вставлять отсеки.Тем самым в порах мембраны образуется градиент хемоаттрактанта. (B) FBS показан как пример соединения, которое заставляет NCC мигрировать через поры и оседать на нижней поверхности мембраны. Примеры изображений показывают окрашенные клетки, которые переместились, а также визуализируют поры, которые имеют номинальный диаметр 8 мкм. Клетки показаны стрелками, поры указаны стрелками. Масштабная линейка: 25 мкм. (C) Анализ NC-MT был выполнен с 5% FBS, добавленным либо в резервуар, либо во вставку, либо в оба отсека.Через 6 ч клетки на нижней поверхности мембраны фиксировали, окрашивали и подсчитывали количество мигрировавших клеток. Данные были нормализованы к условиям максимальной миграции и показаны как средние значения ± стандартное отклонение для трех независимых экспериментов. ***: p <0,001, нс: не значимо, как определено с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим апостериорным тестом Даннета (по сравнению с необработанным контролем). (D) Несколько потенциальных хемоаттрактантов были протестированы в анализе NC-MT. Концентрации составляли 5% для фетальной бычьей сыворотки (FBS), человеческой сыворотки (huSerum) и бычьего сывороточного альбумина (BSA), 20 нг / мл для фактора роста фибробластов 2 и 8 (FGF2 / FGF8), нейротрофических клеток, происходящих из глиальных клеток. фактор (GDNF), фактор 1 стромальных клеток (SDF-1) и эфрин A1, B1 и B2, 50 мкг / мл для основного фактора роста фибробластов (bFGF), 10 нг / мл для Wnt3a, 50 нг / мл для фактор роста тромбоцитов (PDGF), 100 нг / мл для нейротрофического фактора мозга (BDNF), 1 нг / мл для трансформирующего фактора роста β 1 и 3 (TGF-β 1 / TGF-β 3), 1 мкМ ретиноевой кислоты кислота (RA), 3 нг / мл для костного морфогенетического белка 4 и 7 (BMP-4 / BMP-7), 10 нМ для эндотелина 1, 100 нг / мл для интерлейкина-8 (IL-8).UT: без лечения. Данные нормализованы к данным FBS и показаны как среднее ± стандартное отклонение по крайней мере из двух независимых экспериментов. ***: p <0,001 по данным однофакторного дисперсионного анализа с последующим апостериорным тестом Даннета (по сравнению с необработанным контролем). (E) Перед использованием в качестве хемоаттрактанта в нижней (резервуарной) камере (при 5%) FBS расщепляли 0,5% пепсином при pH = 2,0. Контрольный образец (-пепсин) подвергали той же процедуре (подкисление, инкубация в течение 1 часа, буферизация до pH = 7,0), но без пепсина. Активность определяли в анализе NC-MT.Данные нормализованы к необработанной FBS и показаны как средние значения ± стандартное отклонение от трех независимых экспериментов. ***: p <0,001, нс: не значимо, как определено с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим апостериорным тестом Даннета (по сравнению с необработанным контролем). (F) Образцы FBS подвергали термообработке в различных условиях, а затем тестировали при 5% концентрации в анализе NC-MT на хемотаксическую активность. Данные нормализованы к FBS и показаны как среднее ± стандартное отклонение от трех независимых экспериментов. ***: p <0,001, нс: не значимо, как определено с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим апостериорным тестом Даннета (по сравнению с необработанным контролем).

Основной компонент FBS и huSerum, белковый альбумин, не обладал хемотаксической активностью. Однако FBS содержит много других белков, а также множество небольших молекул. Чтобы понять, отвечает ли белок за CTA, мы лечили FBS по-разному, прежде чем тестировать его на хемоаттрактантную активность. Расщепление белков пепсином и денатурация белка нагреванием до 70 ° C инактивировали предполагаемый фактор, способствующий хемотаксису (, рис. 1E, F ). Из этого мы заключаем, что с большой долей вероятности CTA хотя бы частично является белком.

Характеристика фактора запуска хемотаксиса в FBS

Поскольку фактор запуска хемотаксиса в FBS, скорее всего, является белком, мы задались вопросом, можно ли его обогатить или даже очистить. С этой целью несколько традиционных стратегий разделения белков были объединены в общую стратегию. Поскольку альбумин составляет> 60% белка FBS, было важно найти способ его удаления на ранней стадии. Были протестированы различные подходы к фракционному осаждению, и было обнаружено, что оптимизированное последовательное осаждение ацетоном является оптимальным для удаления альбумина.Второй этап обогащения представлял собой очистку с помощью быстрой жидкостной хроматографии белков (FPLC) с использованием анионообменной колонки (HiTrap Q FF). Отдельные фракции были протестированы в анализе NC-MT, и те, которые вызвали повышенную миграцию NCC, были объединены, обессолены и дополнительно очищены с помощью другой анионообменной колонки (HiTrap Q HP) (, рис. 2A, ). Фракции были протестированы непосредственно в анализе NC-MT на их активность, увеличивающую миграцию ( Рисунок S1B ), и мы попытались сохранить их для дальнейшего использования.Мы обнаружили, что все высокоочищенные фракции утратили свою биоактивность по СТА в течение 24 часов. Были опробованы различные подходы к стабилизации белка и улучшенному хранению. Однако мы не идентифицировали процедуру, которая позволяла бы хемотаксис-стимулирующему фактору сохраняться в течение ночи после его высокой степени очистки. Одним из возможных объяснений этой потери активности является то, что «белок CTA» стабилизируется другим белком, который теряется при очистке. Из-за этой ситуации тестирование очистки и биологической активности всегда приходилось проводить в течение одного дня.В качестве альтернативного подхода к хроматографии белков мы использовали ультрафильтрационные мембраны, чтобы получить представление о диапазоне размеров CTA, содержащихся в FBS. Мы обнаружили, что хемоаттрактант ведет себя как белок с молекулярной массой 50–100 кДа ( Рисунок 2B ). Масс-спектрометрический анализ (МС) наиболее активной фракции, очищенной из второй анионообменной колонки, предложил серпин A1, который имеет размер 52 кДа, в качестве потенциального кандидата ( Рисунок S1C ). Подробные последующие и подтверждающие эксперименты показали, что серпин A1 не обладает активностью, способствующей хемотаксису (, фиг. S1D ).Анализ спектров МС показал, что фракция, содержащая серпин А1, содержала по меньшей мере 20 дополнительных белков (не показаны). По этой причине белок CTA может быть легко замаскирован одним из очень распространенных сывороточных белков, таких как серпины (Anderson and Anderson, 2002). Поэтапная очистка, включая осаждение ацетоном и два анионита, позволила очистить в 1000 раз фактор, способствующий хемотаксису, по сравнению с исходным материалом ( Рисунок 2C, Рисунок S1A ). Этого сильного обогащения было недостаточно для идентификации MS, поскольку даже активные фракции содержали сложные белковые смеси.Для решения этой проблемы необходимы дополнительные и более эффективные хроматографические колонки. В качестве альтернативной стратегии мы рассматривали менее сложный исходный материал.

Рисунок 2: Характеристика и очистка фактора, способствующего хемотаксису, фетальной бычьей сыворотки (FBS).

(A) Схема стратегии обогащения хемотаксических факторов из FBS. Активность измеряли с помощью анализа NC-MT после каждой стадии очистки (синие кружки). Активные фракции из первого анионообменника (HiTrap Q FF) объединяли, обессоливали и загружали во вторую анионообменную колонку (HiTrap Q HP).После последней стадии очистки образцы хранили в различных условиях (розовые кружки) в течение 24 часов. После этого активность образцов проверяли в анализе NC-MT. (B) FBS осаждали ацетоном, осадок белка растворяли и наносили на ультрафильтрационные мембраны с различными порогами отсечки. Затем поток (<) и фильтрат (>) тестировали в анализе NC-MT-HTS. Данные нормализованы к нефракционированному FBS и показаны как средние значения ± стандартное отклонение из трех независимых экспериментов.***: p <0,001, нс: не значимо, как определено с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим апостериорным тестом Даннета (по сравнению с необработанным контролем). (C) Удельную активность и коэффициент очистки определяли после каждой стадии очистки. Используемые анионообменники различаются по материалу смолы, нагрузочной способности и расходу. Для расчетов использовали наиболее активные фракции каждого анионита. Данные приведены относительно исходного материала (= FBS).

Активность, запускающая хемотаксис, присутствует в кондиционированной среде клеток HepG2

Мы пришли к выводу, что все белки, присутствующие в сыворотке, продуцируются клетками.Более того, наш скрининг источников CTA показал, что человеческая сыворотка также является биоактивной (, рис. 1D, ). Таким образом, мы выдвинули гипотезу о том, что некоторые клетки человека должны продуцировать белок, ответственный за активность хемоаттрактанта NCC. Чтобы проверить это, мы использовали небольшую панель клеток, включающую клетки гепатомы HepG2, клетки аденокарциномы молочной железы MDA-MB-231, клетки рака шейки матки HeLa, клетки эмбриональной почки человека HEK-239 и клетки нейробластомы SH-SY5Y для изучения продукции CTA ( Рисунок 3A ).В первом подходе мы использовали кондиционированную среду (CM) из всех клеточных линий в анализе NC-MT. Данные показали, что клетки HepG2 и MDA являются мощными продуцентами CTA, клетки HeLa и HEK-239 были умеренными продуцентами, а SH-SY5Y CM был лишен какой-либо активности. Во втором, независимом экспериментальном подходе мы затем подтвердили эти результаты путем культивирования клеточных линий в нижнем отделении установки для анализа хемотаксиса. Клетки нейробластомы SH-SY5Y вообще не обладали хемоаттрактантной активностью, т.е. их присутствие не запускало ни один из NCC для перемещения через мембрану.Это показало, что человеческие клетки (как таковые) не обладают неспецифическими хемоаттрактивными эффектами при совместном культивировании в анализе NC-MT. Клетки, которые были хемоаттрактивными для NCC, имели порядок активности, подобный тому, который был обнаружен для их CM (, рис. 3A, ). Таким образом, некоторые клетки, по-видимому, секретируют белок, который является хемоаттрактивным для NCC. Мы решили сосредоточиться на HepG2 как на продуцирующей клеточной линии. Для первоначальной характеристики исследования стабильности были выполнены на HepG2 CM. Данные этих экспериментов показали, что CTA в этом материале полностью инактивируется перевариванием пепсина и умеренным нагреванием (70 ° C) ( Рисунок 3B, C ).Эти результаты подтвердили, что CTA HepG2 CM является белком. На основе этих знаний был начат метод поэтапной очистки. Осаждение ацетоном использовалось в качестве первого шага, так как оно также выполняло функцию концентрирования и обессоливания. Затем использовали различные хроматографические колонки. Катионообменник (HiScreen Capto SP ImpRes) оказался наиболее эффективным и дал высокообогащенный CTA (, рисунок S2B ). Фракции с наивысшей активностью по увеличению миграции в анализе NC-MT (, фиг. S2A ) использовали для анализа MS.Фибронектин и аполипопротеин-H были последовательно идентифицированы в наиболее активных фракциях ( Рисунок S2C, D ). Мы предположили, что вторая хроматографическая колонка удалит один из этих двух белков и, таким образом, укажет, какой из них может вызвать миграцию. Поэтому активные фракции катионообменной колонки были объединены, обессолены и дополнительно очищены на анионообменной колонке (HiTrap Q HP). Отдельные фракции были протестированы в анализе NC-MT, и только одна фракция вызвала миграцию NCC ( Рисунок 3D ).Разделение по размеру фракции, содержащей CTA, в полиакриламидном геле привело к появлению двух основных белковых полос (, фиг. 3F, ), и анализ МС определил их как фибронектин и сывороточный альбумин / альфа-фетопротеин (AFP) (, фиг. 3G ). Поскольку аполипопротеин-H не присутствовал в активной фракции после второй стадии хроматографической очистки, мы сохранили фибронектин в качестве многообещающего кандидата и исключили аполипопротеин-H. Сывороточный альбумин и AFP имеют 39% гомологии первичной структуры и имеют одинаковую молекулярную массу около 69 кДа (Morinaga et al.1983). Следовательно, анализ МС не позволяет в достаточной степени различать альбумин и АФП. Однако было показано, что лишение сыворотки клеток HepG2 увеличивало продукцию AFP по сравнению с альбумином (Bennett et al. 1998). Более того, мы обнаружили, что очищенный альбумин не является хемоаттрактивным. Поэтому мы взяли AFP в качестве еще одного многообещающего кандидата в CTA. Наше предположение было дополнительно подтверждено идентификацией AFP в HepG2 CM с помощью вестерн-блоттинга (данные не показаны).

Рисунок 3: Характеристика фактора, способствующего хемотаксису, в среде, кондиционированной HepG2 (CM).

(A) Продукция хемоаттрактантных факторов линиями клеток человека была исследована с помощью двух экспериментальных установок: использование кондиционированной среды (CM) и совместное культивирование. Для переноса CM указанные клеточные линии культивировали в среде с 0% FBS в течение 48 часов. Супернатант среды от этих культур собирали и затем использовали для заполнения (нижних) резервуаров анализа NC-MT. Верхняя вставка была заполнена НКЦ и свежей (некондиционированной) средой. Для экспериментов по совместному культивированию клетки указанных линий клеток выращивали на дне резервуара.В начале эксперимента они получали свежую среду с 0% FBS, а спустя 48 часов NCC добавляли в транс-лунки над клеточными линиями в свежей среде (верхний отсек). В обоих случаях NCC позволяли мигрировать в течение 6 часов, прежде чем количество клеток, достигших нижней стороны мембраны, было определено количественно. Данные приведены к миграции, инициированной 5% FBS. Они показаны как средние значения ± SEM по крайней мере из трех независимых экспериментов. **: p <0,01, ***: p <0,001, ns: не значимо, как определено с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим апостериорным тестом Даннета (по сравнению с необработанным контролем).(B) Перед использованием в качестве хемоаттрактанта в нижней (резервуарной) камере HepG2 CM расщепляли пепсином, как показано на фиг. 1E. Данные нормализованы для HepG2 CM и показаны как средние значения ± стандартное отклонение из трех независимых экспериментов. ***: p <0,001, нс: не значимо, как определено с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим апостериорным тестом Даннета (по сравнению с необработанным контролем). (C) Образцы HepG2 CM были подвергнуты термообработке в различных условиях, а затем протестированы при 5% концентрации в анализе NC-MT на хемотаксическую активность.Данные нормализованы по HepG2 CM и показаны как средние ± стандартное отклонение из трех независимых экспериментов. ***: p <0,001, нс: не значимо, как определено с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим апостериорным тестом Даннета (по сравнению с необработанным контролем). (D) Фактор, запускающий хемотаксис, в HepG2 CM очищали осаждением ацетоном с последующим использованием катионообменной колонки (HiScreen Capto SP ImpRes) и анионообменной колонки (HiTrap Q HP). Фракция 2 (F2) и объединенные фракции F18-25 (F18-25) из катионита, а также фракции 4-15 из анионита были протестированы при конечной концентрации 20% (80% свежей среды) в NC. -MT-HTS анализ.В качестве положительного контроля использовали 5% FBS и 100% HepG2 CM. UT: без лечения. Данные представляют собой средние значения ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов. *: p <0,05, **: p <0,01, ***: p <0,001 по данным однофакторного дисперсионного анализа с последующим апостериорным тестом Даннета (по сравнению с необработанным контролем). (E) Удельную активность и коэффициент очистки определяли после каждой стадии очистки. (F) Образцы осаждения ацетоном (40% ацетон), фракция 2 (F2) и объединенные фракции 18-25 (F18-25) из катионита, а также фракции 7-11 из анионита были разделены на 10% SDS-гель и полосы визуализировали окрашиванием серебром.Полосы, вырезанные для анализа МС, отмечены красным. 1: фибронектин, 2: альфа-фетопротеин. (G) Белки во фракции 9 из анионита были разделены на 10% геле SDS, и две полосы были вырезаны для анализа масс-спектрометрии (MS). В таблице представлены результаты МС для полос 1 и 2 фракции 9, обнаруживающие фибронектин и альфа-фетопротеин как наиболее распространенные белки. Анализ МС был выполнен из двух независимых экспериментов с одинаковыми результатами.

Для дальнейшего сужения идентичности CTA мы решили сосредоточиться на двух наиболее распространенных белках, присутствующих в активной фракции, фибронектине и AFP.Чтобы исследовать роль фибронектина, его удалили из HepG2 CM путем аффинного осаждения с использованием гранул желатин-сефарозы (, рисунок S3C, D ). Тестирование в анализе NC-MT показало, что HepG2 CM без фибронектина имеет такой же эффект увеличения миграции на NCC, что и HepG2 CM с фибронектином ( Рисунок S3B ). Поэтому мы исключили фибронектин как потенциальный хемоаттрактантный фактор в HepG2 CM. Два других белка, идентифицированных с помощью MS, были исключены как вероятные загрязнители: Дермцидин присутствует в человеческом поте и поэтому часто обнаруживается в образцах MS (, рисунок 3G ).Кроме того, ядерный белок ламины ламин-B1 был отвергнут как вероятный кандидат ( Рисунок 3G ). Поскольку клетки нейробластомы SH-SY5Y вообще не проявляли хемоаттрактантной активности в анализе NC-MT ( Рисунок 3A, Рисунок S4A ), а КМ, полученный из этих клеток, не содержал альбумина или AFP ( Рисунок S4B ), мы экспрессировали рекомбинантный АФП в клеточной линии нейробластомы. Сконструированные клетки SH-SY5Y продуцировали AFP (фигура S4D, E ), но не проявляли хемотаксической активности в анализе NC-MT (фигура S4C ).На основании этих данных мы пришли к выводу, что AFP не является фактором, способствующим хемотаксису в HepG2 CM. Таким образом, наш подход к очистке, который привел к обогащению исходного материала в 5000 раз ( Рисунок 3E ), не позволил идентифицировать CTA. Тем не менее, нам удалось в высокой степени обогатить фактор хемотаксиса НСС человека. Активные фракции HepG2 содержали явно меньше белка, чем активные фракции FBS, но получение супернатанта требовало больших ресурсов. Более того, нельзя исключить, что раковые клетки производят фактор, который не является физиологически значимым.Поэтому мы рассмотрели другие источники.

Лизат тромбоцитов человека в качестве альтернативы CTA, не содержащей животных.

Лизат тромбоцитов человека — это высококачественный продукт человеческого происхождения, богатый факторами роста. Он оказался оптимальным альтернативным исходным материалом, поскольку он коммерчески доступен. В пилотном эксперименте мы сами произвели небольшое количество huPL и наблюдали сильную биоактивность в анализе NC-MT (не показано). Чтобы решить эту проблему, мы получили huPL от различных поставщиков. Мы были удивлены, обнаружив, что huPL содержал большое количество альбумина ( Рисунок S5A ).Наши исследования показали, что плазма добавляется во все коммерческие ГУП. Поставщики утверждали, что это необходимо для стабилизации факторов тромбоцитов и обеспечения оптимального роста клеток, когда huPL используется в качестве добавки к культуре клеток (Chou and Burnouf 2017; Horn et al. 2010). Когда мы протестировали различные партии коммерчески доступных huPL в анализе NC-MT, мы обнаружили, что этот материал сильно запускал миграцию NC (, рис. 4A, ). На следующем этапе мы использовали наши установленные процедуры, чтобы убедиться, что белок лизата отвечает за хемотаксис.Данные этих экспериментов показали, что CTA в huPL инактивируется перевариванием пепсином и нагреванием (, фиг. 4B, C ). Таким образом, мы пришли к выводу, что фактор, способствующий хемотаксису в huPL, представляет собой белок, подобный фактору, присутствующему в FBS и HepG2 CM. Для очистки CTA мы оптимизировали стратегию и начали с этапа хроматографической очистки с использованием катионообменной колонки HiScreen Capto SP ImpRes ( Рисунок 4D, Рисунок S5B ). Затем производили осаждение ацетоном полученных объединенных активных фракций.Таким образом, гранулы можно заморозить и хранить при -20 ° C. Благодаря этой улучшенной процедуре отпала необходимость выполнять все стадии очистки в течение одного дня. Кроме того, многие гранулы ацетона могут быть объединены и может быть произведена большая партия для дальнейшей очистки. Недостатком этого процесса было то, что гранулы трудно растворялись, и часть материала терялась. Пропуская повторно растворенный материал через анионообменную колонку (HiTrap Q HP), CTA можно в конечном итоге очистить до 2000 раз по сравнению с исходным материалом (, рис. 4E, ).

Рисунок 4: Характеристика фактора, способствующего хемотаксису, из тромбоцитов человека.

(A) Несколько коммерчески доступных huPL (партии a-c) были протестированы при конечной концентрации 5% в анализе NC-MT. Гепарин (в конечной концентрации 2 Ед / мл) добавляли к партиям b и c, чтобы предотвратить коагуляцию среды. FBS (5%) использовали в качестве положительного контроля. Данные нормализованы к FBS и показаны как средние ± стандартное отклонение для трех независимых экспериментов. ***: p <0,001 по данным однофакторного дисперсионного анализа с последующим апостериорным тестом Даннета (по сравнению с необработанным контролем).(B) Перед использованием в качестве хемоаттрактанта в нижней (резервуарной) камере (при 5%) huPL был расщеплен 0,5% пепсином (как на фиг. 1E). Данные нормализованы к huPL и показаны как средние ± стандартное отклонение от трех независимых экспериментов. ***: p <0,001, нс: не значимо, как определено с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим апостериорным тестом Даннета (по сравнению с необработанным контролем). (C) образцы huPL подвергали термообработке в различных условиях, а затем тестировали при 5% концентрации в анализе NC-MT на хемотаксическую активность.Данные нормализованы к huPL и показаны как средние ± стандартное отклонение от трех независимых экспериментов. ***: p <0,001, нс: не значимо, как определено с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим апостериорным тестом Даннета (по сравнению с необработанным контролем). (D) Схема стратегии обогащения хемотаксическими факторами из лизата тромбоцитов человека (huPL). Лизат тромбоцитов фракционировали на катионообменной колонке (HiScreen Capto SP ImpRes) с последующим осаждением ацетоном и анализом материала осадка на анионообменной колонке (HiTrap Q HP).(E) Удельную активность и коэффициент очистки определяли после каждой стадии очистки.

Покадровый анализ хемотаксической активности FBS, HepG2 CM и huPL

Установив три способа получения мощного хемотаксического фактора NCC в популяционном анализе (NC-MT), мы были заинтересованы в получении дополнительных и дополнительных результатов. прямое доказательство хемотаксической активности отдельных клеток. Анализ NC-MT определяет количество мигрировавших клеток в конце анализа, и клетки не наблюдаются во время миграции.Чтобы избежать этих проблем, мы провели анализ хемотаксиса на µ-слайдах. Эта установка использует сложный формат клеточной культуры (произведенный ibidi), в котором клетки могут быть помещены в стабильный химический градиент и наблюдаться в течение нескольких часов. ( Рисунок 5A , Рисунок S6A ). Клетки наблюдали с помощью покадровой визуализации, и визуализировали пути миграции отдельных клеток. Первоначальный контроль показал, что NCC мигрировали во всех направлениях, когда не было хемоаттрактанта ( Рисунок 5B слева ).Когда клетки подвергались воздействию одинаковой концентрации хемоаттрактанта с обеих сторон, они мигрировали по направлению к обоим стимулам примерно с одинаковой частотой ( Рисунок 5B справа ). Для классического тестирования хемотаксиса только один резервуар был заполнен хемоаттрактантом (FBS, HepG2 CM или huPL), чтобы клетки находились в пределах стабильного градиента. В этих условиях они мигрировали в сторону более высокой концентрации хемоаттрактанта ( Рисунок 5C ).

Рисунок 5: Отслеживание отдельных клеток для сравнения хемотаксической активности FBS, huPL и HepG2 CM.

(A) Графическая иллюстрация установки для анализа хемотаксиса µ-слайда, как видно сверху (там же). Клетки высевали в зазор шириной 1 мм между резервуарами (продолговатое среднее отделение). Резервуары с обеих сторон (показаны треугольниками) были либо заполнены средой (-), либо хемоаттрактантом, растворенным в среде (+). (B) Репрезентативные траектории клеток (записанные в течение 24 часов) 20 NCC со средой в обоих резервуарах (контроль 1, слева) или FBS (5%) в обоих резервуарах (контроль 2, справа). Для количественной оценки миграции камеру помещали на столик микроскопа, и движение клеток наблюдали с помощью покадровой видеосъемки.Черная точка — это начальная точка всех ячеек в повторно нормализованной системе координат (наложение всех начальных точек ячеек). Пунктирная линия была вставлена ​​в качестве наглядного пособия, чтобы обозначить «водораздел» градиента. График плотности в верхнем правом углу был построен путем разделения области миграции на 36 секторов (каждый шириной 10 °), начиная с точки происхождения миграции. Длина сегментов указывает на распределение количества ячеек внутри секторов. Для визуализации секторы попеременно окрашивались в синий и черный цвета.(C) Репрезентативные траектории клеток (записанные в течение 24 часов) 20 NCC со средой в правом резервуаре и FBS, huPL или HepG2 CM, заполненными в левом резервуаре. Номера для каждой отдельной ячейки указаны на правом рисунке только для графических целей.

Программное обеспечение, предоставленное поставщиком камеры для анализа, позволяло количественно определять миграцию параллельно или перпендикулярно градиенту ( Рисунок S6A ). Хемотаксис определяется этой программой как форма миграции, которая более эффективна параллельно градиенту, чем перпендикулярно ему.Добавление FBS, HepG2 CM или huPL в один резервуар привело к четкому хемотаксису ( Рисунок S6B ). Результаты подтвердили, что FBS, HepG2 CM и huPL запускают хемотаксис в отдельных NCC. Более того, NCC в градиенте HepG2 CM или huPL мигрировали также на большие расстояния и быстрее, по сравнению с контрольными клетками ( Рисунок S6D ). В заключение, FBS, HepG2 CM и huPL являются подтвержденными источниками CTA для NCC.

Заключение и перспективы

В целом, мы показали здесь, что можно создать анализ in vitro для направленной миграции клеток нервного гребня человека (хемотаксиса), ключевого процесса в развитии плода.Человеческий материал может использоваться исключительно для анализа, и это выходит за рамки оценки способности ненаправленных движений (хемокинез). Таким образом, его можно использовать для изучения процессов и факторов (патологических, токсикологических или фармакологических), которые специфически влияют на восприятие хемоаттрактивного градиента и, соответственно, на направленное движение NCC. Мы также продемонстрировали, что анализ позволяет получать высококоличественные данные, поскольку он успешно использовался здесь для определения спектра биоактивности хроматографических фракций или препаратов CTA после различных обработок (нагревание, протеазы и т. Д.)). Это ключевая особенность, важная для разработки новых методов подхода (NAM), которые можно использовать для тестирования потенциальных токсических веществ, связанных с развитием (в частности, нейротоксикантов развития). В прошлом огромные исследовательские усилия были вложены в модели миграции нервного гребня на животных, а поиск релевантных для человека хемотаксических факторов игнорировался. Для этой цели наземные работы, как описано здесь, имеют важное значение для обеспечения основы нового поколения тестов, основанных только на человеческих клетках и человеческих материалах и процессах (здесь хемоаттрактантные факторы, покрытие клеточной культуры, клеточная среда для культивирования).Несмотря на то, что нам еще не удалось идентифицировать белок, который можно продуцировать рекомбинантно и в дальнейшем использовать для таких анализов, мы предоставили здесь протоколы, которые показывают, как можно получить подходящие фракции белка для установления NAM.

Мы описали здесь три источника CTA: супернатант HepG2, huPL и сыворотку. Что касается последнего источника, большая часть работ была сосредоточена на FBS, но мы показали, что человеческая сыворотка также является биоактивной. В самом деле, у нас нет точных доказательств того, что фактор, способствующий хемотаксису в huPL, является белком тромбоцитов.Коммерчески доступные huPL всегда содержали сывороточные белки. В качестве альтернативного подхода мы сами производили очищенные тромбоциты. Они содержали явно меньше белков плазмы, чем коммерческий huPL, но мы не можем полностью исключить контаминацию.

Возможно, существует не только один белок с CTA, и такие факторы могут работать независимо, или они могут работать синергетически. Мы полагаем, что существуют убедительные доказательства присутствия в сыворотке по крайней мере одного фактора. Во-первых, потому что мы находим КТА в бесклеточной сыворотке; во-вторых, потому что клетки HepG2, которые, как известно, продуцируют сывороточные белки (Franko et al.2019; Trefts et al. 2017) производят такой фактор. На основании имеющихся данных невозможно решить, является ли фактор, обнаруженный в сыворотке крови и фактор в супернатантах HepG2 (или huPL) одним и тем же белком.

Для более точного определения белкового фактора необходимы дополнительные усилия. Комбинация лучших хроматографических подходов вместе с обширной масс-спектрометрической характеристикой всех фракций может обеспечить шаг вперед. Однако эта стратегия может быть полностью разработана только в том случае, если есть возможность стабилизировать и хранить высокобиоактивные фракции.В настоящее время потеря биоактивности наиболее активных фракций в течение 24 часов делает стратегии очистки чрезвычайно сложными. Кроме того, увеличение количества исходного материала ограничивается связывающей способностью хроматографических колонок. Чтобы обойти эти ограничения, необходимо удаление нежелательных белков из исходного материала и одновременное концентрирование оставшихся белков (например, на стадии осаждения). Другой проблемой является потенциально высокая биологическая активность хемотаксического фактора вместе с его чрезмерным разбавлением другими белками.Если фактор обладает гормональными / цитокиноподобными свойствами, он, вероятно, имеет низкую аффинность нМ или даже пМ и, следовательно, может присутствовать только в концентрациях пМ. Такой белок может быть легко замаскирован очень распространенными белками сыворотки, например при разделении геля. Такие проблемы хорошо известны в биологии, и некоторые из наиболее очевидных и важных биоактивных молекул невозможно очистить традиционными методами. Это применимо, например, к рецептору эритропоэтина, рецептору кортикотропного гормона или рецептору фактора некроза опухоли, которые в конечном итоге были идентифицированы клонированием функциональной экспрессии (Beutler et al.1985; Chen et al. 1993; D’Andrea et al. 1989). Такие стратегии могут быть использованы в будущем для идентификации факторов хемотаксиса, учитывая, что биоанализ работает с относительно высокой производительностью.

Вышеупомянутые стратегии очистки представляют среднесрочный и долгосрочный интерес, поскольку они влияют на физиологию человека. Они также могут дать некоторые преимущества при разработке и применении анализов. Однако для дальнейшего использования очищенный фактор вовсе не обязателен. Биология имеет давнюю и успешную традицию использования сложных материалов, часто не полностью определенных по своему составу, для количественных анализов.Мы показали здесь процедуры очистки CTA в несколько тысяч раз, что уже является промежуточным шагом на пути к более определенному материалу. Что наиболее важно, мы продемонстрировали, как FBS можно обменять на полностью человеческий материал, и на этой основе можно создать полное гуманизированное NAM.

Широкий приемник | Руководство по позиционированию в футболе

Физические измеримые параметры:

• Высота: 6 футов 2 дюйма
• Вес: 190 фунтов.

Статистика:

• 40 ярдов: 4.5
• Скамья: 235 фунтов.
• Приседания: 315 фунтов.

Ключи от автобуса:

Должен быть постоянной угрозой каждый раз, когда он находится на поле. Должен иметь мгновенное освобождение от прямой видимости с низким уровнем площадки и небольшим бесполезным движением, рывком по маршруту, срезанием на один шаг, безупречной ловкостью и способностью отделиться от защитников с редкой максимальной скоростью и неуловимостью. Он должен уметь ловить спорной мяч так же легко, как столб, мелкий, наклонный или заминный.Он должен комфортно бегать по всем маршрутам, обладать редкими навыками владения мячом, иметь отличное сочетание размера и скорости, а также готовность блокировать. Он многолетний игрок штата, а в некоторых случаях — всеамериканец.

---

Физические измеримые параметры:

• Высота: 6’0 «
• Вес: 175 фунтов.

Статистика:

• 40 ярдов: 4,6
• Скамья: 225 фунтов.
• Приседания: 295 фунтов.

Ключи от автобуса:

Должен иметь мгновенный выход из зоны прямой видимости с низким уровнем подушки, рывком по маршруту, срезанием на один шаг, выдающейся ловкостью и способностью отделяться от защитников своей скоростью.Он должен уметь ловить спорной мяч так же легко, как сетку, уклон или заминку. Он должен комфортно бегать по всем маршрутам, обладать очень хорошими навыками владения мячом и готовностью блокировать. Он получил награды Общегосударственных и Всеконференционных.

---

Физические измеримые параметры:

• Высота: 5’10 «
• Вес: 165 фунтов.

Статистика:

• 40 ярдов: 4,6
• Скамья: 205 фунтов.
• Приседания: 275 фунтов.

Ключи от автобуса:

Должен иметь быстрое освобождение от прямой видимости, хорошее зрение и инстинкты, хорошие руки, скорость, чтобы защитники промахнулись. Он, как правило, очень атлетичен, быстрее, чем быстр, или обладает скоростью, и он слишком мал для этой позиции. Он готов блокировать и играет с большим мотором. Он получил почетные звания всех конференций.

---

Физические измеримые параметры:

• Высота: 5’8 «
• Вес: 150 фунтов.

Статистика:

• 40 ярдов: 4,7
• Скамья: 200 фунтов.
• Приседания: 265 фунтов.

Ключи от автобуса:

Должен уметь быстро выходить из строя, продавать маршрут игры, делать точные врезки в / из брейков, постоянно ловить мяч и, как правило, быстрее, чем быстро. У него должен быть как минимум 1 год студенческого футбольного опыта.

Рейтинги КВ в предсезонке студенческого футбола 2021: Все 130 стартовавших в FBS | Колледж футбол

Как и в случае с НФЛ, квотербек — безусловно, самый важный игрок на поле в студенческом футболе.Если команде не хватает жизнеспособного сигнального игрока, о месте в плей-офф колледжа футбола или о броске на чемпионате конференции не может быть и речи. И команде, безусловно, нужен лучший распасовщик, чтобы получить высшую честь стать национальным чемпионом.

Это, конечно, вызывает вопрос: какие программы находятся в лучшей и худшей форме на позиции квотербека, когда мы с нетерпением ждем сезона студенческого футбола 2021 года?

С помощью расширенной базы данных PFF College мы можем перейти к ответу на этот вопрос.Принимая во внимание индивидуальный оценочный профиль каждого предполагаемого стартера и несколько других точек данных, в дополнение к обзору фильмов и схем, вот ежегодные рейтинги квотербеков колледжей PFF для всех 130 программ FBS. И наряду с ранжированием каждой ситуации от 1 до 130, квотербэки сгруппированы по уровням, чтобы обеспечить дополнительный контекст того, где каждая школа находится в начале падения.

Обратите внимание, что не у каждой команды есть имя стартера на данный момент. Для этих программ учитывалась ситуация в целом.Эти рейтинги не учитывают потенциал НФЛ.

УРОВЕНЬ 1: ЭЛИТА

Эти квотербэки встречаются нечасто. Они лучшие прохожие в студенческом футболе. Лидеры Heisman. Тип игроков, у которых глаза широко раскрываются по несколько раз за игру. В прошлом защитниками этого уровня были Бейкер Мэйфилд, Кайлер Мюррей, Джо Берроу, Тревор Лоуренс и Джастин Филдс. Чтобы получить место на этом уровне, должен быть убедительный аргумент, что квотербек — один из лучших в эпоху PFF College.И в этом году в этом разговоре только одно имя…

1. OKLAHOMA: SPENCER RATTLER

Раттлер занял стартовую позицию в «Оклахоме» в качестве новичка в красной рубашке в прошлом сезоне, надеясь продолжить доминирование «Сунерс» на позиции квотербека под руководством главного тренера Линкольна Райли. Ростовщик ростом 6 футов и 205 фунтов оправдал ожидания, получив проходной балл 92,5, который занял шестое место среди квотербеков Power Five в эпоху PFF College. И стоит отметить, что пять впереди него защитников были старшеклассниками, тогда как Раттлер был первокурсником в красной рубашке.

В

Rattler есть немного от Техаса Патрика Махоумса, как стилистически, так и ситуативно. У него сверхбыстрый и легкий выпуск, который сочетается с потрясающим талантом руки и элитной способностью играть вне структуры. Квотербек из Оклахомы показал проходной балл 91,3 и процент точных пасов 69,7% при создании вне структуры в 2020 году, оба из которых опередили всех прохожих FBS. Этот проходной балл опередил Джо Берроу за лучшую оценку, когда-либо полученную квотербеком Power Five.

Раттлер — лучший игрок, вернувшийся в студенческий футбол, и должен стать фаворитом на получение трофея Хейсмана, когда 28 августа начнется сезон студенческого футбола 2021 года.

УРОВЕНЬ 2: ВЫСОКИЕ ПОТОЛКИ

Полузащитники этого уровня бывают всех форм и размеров. У некоторых есть один или несколько сезонов высокоуровневой игры для своих школ, в то время как другие либо только продемонстрировали способности, либо не имеют опыта работы с инструментами и экосистемой, чтобы достичь этого.Кроме того, лишь немногие из этих прохожих имеют возможность претендовать на место в первом ряду элитных квотербеков колледжей.

2. СЕВЕРНАЯ КАРОЛИНА: СЭМ ХАУЕЛЛ

Северная Каролина готовится к нападению, когда Хауэллу дают зеленый свет на передачу пасов, потому что он, возможно, бросает лучший глубокий мяч в студенческом футболе. За последние два сезона Хауэлл занимает первое место в Power Five по завершениям на 20 с лишним ярдов (66), пасовым ярдам (2654), приземлениям (32) и точным броскам (на 59-15 больше, чем в следующем QB).

Журнал PFF’s College Football Preview Magazine 2021 предлагает уникальное глубокое погружение в каждую команду и каждую конференцию в FBS. Вы получите оценки PFF, разбивку по позициям, прогнозы ставок, данные о точности и многое другое, что сделает его единственным ресурсом, который вам понадобится для подготовки к сезону студенческого футбола 2021 года.

Давление было ахиллесовой пятой Хауэлла, как для настоящего первокурсника в 2019 году, поскольку он получил проходной балл 38,2, когда натиск соперника дошел до цели. В 2020 году он улучшил эту оценку до 74,7, сохранив проходной балл в топ-10 по чистым карманам.Он закончил сезон 2020 года шестым по результативности квотербеком (92,3).

Как он живёт без того оружия, которое было в его распоряжении в качестве младшего школьника, — это то, на что стоит обратить внимание этой осенью. Если Хауэлл сможет показать дальнейший рост без широких ресиверов Даями Брауна и Дазза Ньюсома и бегущих бэков Хавонте Уильямса и Майкла Картера, он присоединится к Rattler на Уровне 1.

3. МАЙАМИ (Флорида): D’ERIQ KING

U надеялся на элитного квотербека с двойной угрозой в 2020 году — и, черт возьми, Кинг справился.В своем первом сезоне с «Ураганами» он провел множество розыгрышей как в воздухе, так и на земле, в результате чего в сезоне получил 10-е место в рейтинге FBS с оценкой 90,6 балла по рейтингу PFF. И теперь они получают его еще на год.

За 111 пробежек — 85 рассчитанных и 26 схваток — Кинг провел 26 рывков на 10 и более ярдов. После контакта в 13 попытках он показал больше 10 ярдов, больше всего на позиции. Квотербек ростом 5 футов 11 дюймов 202 фунта также редко наносит ущерб мячу, занимая первое место.3 в рейтинге FBS по текучести (1,7%).

4. UCF: DILLON GABRIEL

Основой успеха Габриэля в колледже стало его касание в полузащите в нападении UCF, набитом мячами го. В прошлом году он занял второе место в рейтинге FBS по дальним пасам (1338). В прошлом году Габриэль занял четвертое место в рейтинге с 1316 первокурсниками. Он следил за мячом и редко принимал плохие решения в 2019 году и снова соответствовал этому стандарту в 2020 году, заняв первое место.9 в ФБС по обороту достойная игра. Во 2-м классе он сделал большой шаг вперед, подняв свою оценку PFF с 81,4 до 90,9.

Будет интересно посмотреть, как он себя чувствует после ухода Джоша Хёупеля, поскольку нарушение бывшего главного тренера UCF было полно упрощенного прочтения, давая Габриэлю изрядную дозу один-на-один вертикальных выстрелов по боковой линии, экранам, RPO и игре. действие.

5. ИНДИАНА: МАЙКЛ ПЕНИКС-МЛАДШИЙ.

Несмотря на то, что в 2020 году он играл за одной из худших линий нападения в студенческом футболе, Пеникс набрал 82 очка.9 баллов PFF за шесть стартов, прежде чем разорвать свой ACL на 13-й неделе. Только четыре других квотербека FBS потратили большее количество отказов под давлением, чем Пеникс (41%), но Хузье преодолел это, чтобы обеспечить качественную игру. Он оставался спокойным, когда рушились карманы, превращая давление в мешки с астрономически низкой скоростью 7,4%, лучшей оценкой в ​​FBS.

Ничего из этого не удивительно после того, что мы видели у Пеникса еще в 2019 году, когда он опубликовал оценку 84,0 PFF за шесть стартов. И хотя его точность была не такой стабильной, как в 2019 году, он все же показал положительные результаты в этой области в 2020 году, заняв 19-е место в FBS по проценту точных передач, выполненных на 10 с лишним ярдов ниже поля.

В прошлом сезоне Пеникс стал лидером среди всех квотербеков Power Five по результативности бросков и до травмы зарекомендовал себя как один из лучших распасовщиков в стране. Если он будет оставаться здоровым, Hoosiers может снова войти в десятку лучших в 2021 году.

6. OLE MISS: MATT CORRAL

В 2021 году Коррал будет вести выгодное нападение, а Лейн Киффин возглавит атаку. Игра Коррала на 7-й неделе в прошлом сезоне против Арканзаса была его единственным событием в кампании, поскольку он совершил шесть перехватов и заработал 30.8 проход в кошмарном старте. Несмотря на это, он по-прежнему получил за сезон оценку PFF 90,5. Остаток года он был так хорош.

Коррал занял пятое место по глубине пасов (1265 ярдов) в 2020 году. По количеству бросков на 10 с лишним ярдов вниз по полю квотербек Оле Мисс занял пятое место по проценту точных передач. Даже с шестью перехватами ему все равно удалось войти в 20-ку среди квотербеков FBS по отрицательно оцененной скорости бросков. Он соединил это с 11-м лучшим положительно оцененным показателем бросков, что сделало его одним из шести квотербеков Power Five, которые вошли в двадцатку лучших в обеих категориях.Было также несколько случаев, когда он проявлял изобретательность и манипулировал защитниками глазами и плечами.

7. ПРИБРЕЖНАЯ КАРОЛИНА: ГРЕЙСОН МАККАЛ

Прибрежная Каролина была историей Золушки студенческого футбола в 2020 году, и МакКолл был главной причиной этого. Он, безусловно, наносил урон на земле, но в отличие от большинства квотербеков с тройным опционом, он также продемонстрировал способность преодолевать защиту в воздухе с максимальной точностью.

МакКолл закончил сезон с седьмым по величине показателем результативности бросков и пятым по величине показателем неуловимых передач по броскам за линией схватки.Это привело к проходному баллу 92,5 за год, уступив только теперь Нью-Йорк Джету Заку Уилсону, получившему лучшую оценку квотербэка, не принадлежавшего к Power Five в эпоху PFF College.

Смертельная атака на прибрежную Каролину не исчезнет в 2021 году под руководством МакКолла.

8. КЛЕМСОН: Д.Дж. УЯГАЛЕЙ

Уягалелей был одним из лучших новобранцев класса 2020 года главного тренера Дабо Суинни — пятизвездочный игрок, занявший 10-е место в национальном рейтинге, по данным 247Sports. Когда Тревор Лоуренс заболел COVID-19, Уягалелей был впечатлен в первых стартах как настоящий первокурсник.Он получил проходной балл 83,6, пять отличных бросков и достойные игры с нулевой текучестью против Бостонского колледжа и Нотр-Дама. И Уягалелей также показал, что у него есть ракетная установка вместо руки.

Мы видели несколько неточных бросков, вызванных механическими проблемами, но это не повод для беспокойства. Уйагалелей продемонстрировал все необходимые инструменты, чтобы попасть в этот элитный уровень квотербеков колледжа, и не был защищен легкими бросками.

9. LSU: MYLES BRENNAN

Бреннан намного превзошел ожидания в трех стартах, прежде чем потерпел поражение из-за травмы в конце сезона в прошлом году.Он сделал в общей сложности 145 дропбэков против Миссисипи Стэйт, Вандербильта и Миссури и ушел с проходным баллом 88,3, 10 крупными бросками и всего одной игрой, достойной ухода. Хотя было несколько упущенных возможностей, пас Бреннана в этих трех играх был не чем иным, как исключительным. Он уступил только Патриоту Новой Англии Мак Джонсу наивысший проходной балл в SEC по броскам на 10 с лишним ярдов за этот промежуток и занял первое место только по глубоким проходам.

Квотербек СЛС не давал защитникам возможности сыграть с мячом, показал качественную руку и продемонстрировал значительный рост в том, как он справлялся с давлением.В своей последней игре против Миссури он был бесстрашен в схлопывании карманов: 11 из 16 на 248 ярдов и пара очков в таких играх. Когда Бреннан выздоровел и здоров, LSU должен восстановиться после разочаровывающего 2020 года.

10. USC: KEDON SLOVIS

Slovis здесь катается по тонкому льду, но удерживает 10-е место. Он превзошел все ожидания как истинный первокурсник в 2019 году, получив проходной балл 80,8 и продемонстрировав точную точность. Тем не менее, Словис часто выглядел как игрок-первокурсник и совершал один-два принудительных броска, ломающих голову, за игру.Он также изо всех сил пытался удержать мяч в схлопывающихся лузах.

Квотербек USC Trojans Кедон Словис (9) надеется передать мяч в первой половине игры против «Пумы штата Вашингтон» на поле United Airlines в Мемориальном Колизее Лос-Анджелеса. Предоставлено: Джейн Камин-Онеа-США СЕГОДНЯ Спорт

Вместо того, чтобы сделать следующий шаг вперед, он был тем же игроком в 2020 году. Он получил проходной балл 80,1 за шесть стартов, в которых участвовало 13 игр, достойных текучести, но высочайшая точность внизу. .

Slovis еще не находится в элитном классе, но у него есть набор навыков, чтобы совершить прыжок в 2021 году.

11. НЕВАДА: КАРСОН СТРОНГ

Стронг вступает в 2021 год с акцентом на него после того, как вырвался из игры в 2020 году и стал известен как один из сильнейших квотербеков в стране. В прошлом сезоне он получил проходную оценку 85,8, что соответствует пятому месту по количеству игр, достойных текучести, в FBS (1,7%). Стронг совершил четыре приземления, пролетев по воздуху более 50 ярдов. Это максимум за один сезон в эпоху колледжа PFF — ни у одного другого квотербека в FBS в 2020 году не было больше одного.

12. ШТАТ КЕНТ: ДАСТИН КРУМ

Крам вместе с Грейсоном МакКоллом и Карсоном Стронгом считается лучшим квотербеком не из Power Five в этом сезоне. Звонящий по сигналу с двойной угрозой получил оценки PFF 91,7 и 85,1 за последние два сезона. Мяч выскакивает из его руки как распасовщик. Он подключился к шести приземлениям, которые пролетели более 40 ярдов в воздухе с 2019 года, что уступает только Сэму Хауэллу, Джастину Филдсу и Карсону Стронгу по большинству в FBS. И он сделал это, несмотря на то, что в 2020 году сыграл всего четыре игры.

13. ШТАТ АРКАНЗАС: ЛЭЙН ХАТЧЕР

Хэтчер занимает третье место среди прохожих Группы пяти за последние два года после переезда из Алабамы, куда он пошел дальше. Он также входит в десятку лучших как по результативному броску, так и по рейтингу игры. Он вел себя сверхагрессивно на полях, давая среднюю глубину цели 13,2 ярда с 2019 года — самый высокий показатель в Группе пяти за тот же период. Он справился с этими глубокими мячами, разместив первые 10 оценок в FBS за проходной балл, высокую скорость бросков и идеальную передачу при бросках на 10 с лишним ярдов.

Штат Арканзас использовал сводящую с ума систему двух квотербеков в 2020 году, которая положила начало Логану Боннеру, но время от времени меняла его на Хэтчера. Решение стало неожиданностью, мягко говоря, поскольку Хэтчер выставил элитную проходную оценку 90,0, заменив травмированного Боннера в 2019 году. Почти предсказуемо, Хэтчер в конечном итоге получил лучшую проходную оценку в 2020 году (82,6 против 71,1) и выполнил. более эффективное нарушение паса (0,24 EPA за пас против 0,12). Поклонники штата Арканзас должны быть счастливы, что он возьмет бразды правления в свои руки в 2021 году.

14. ФЛОРИДА: ЭМОРИ ДЖОНС

Джонс еще не начал играть за свои три года во Флориде, но он все еще демонстрирует впечатляющие черты характера.

Элитный атлет для квотербека, Джонс может похвастаться настоящим профессиональным талантом, получив проходной балл 80,6 за 87 попыток карьерного роста. В своем первом сезоне 2018 года, когда он бегал, он справлялся с проблемами неуклюжести, но исправил это и с тех пор выставил оценку 81,7 на 76 керри за последние два года. Для сравнения, бывший квотербек штата Огайо Джастин Филдс был единственным звонившим в FBS, который поставил высокую оценку к северу от 80.0 в 2020 году.

У

Джонса могут быть более заметные рекрутинговые характеристики и опыт, но неудивительно, что он станет Джо Берроу или Заком Уилсоном в студенческом футбольном сезоне 2021 года. Самым заманчивым в его ситуации является то, что он сотрудничает с одним из ведущих наступательных умов страны Дэном Малленом, у которого будет первый квотербек с двойной угрозой в качестве главного тренера Флориды.

15. МИССУРИ: КОННОР БАЗЕЛАК

Многие программы Комиссии по ценным бумагам и биржам имеют дело с некоторой неопределенностью квотербеков, вступающих в сезон 2021 года, но не с Missouri Tigers.Базелак занял стартовую позицию к третьей игре сезона 2020 года и получил проходной балл 77,4, что означает девятое место среди вернувшихся квотербеков Power Five.

Он превосходно выступал из чистого луза — самый стабильный аспект игры квотербека — а также был качественным распасовщиком в полузащите. Когда его держали в чистоте и бросали 10 с лишним ярдов вниз по полю, оценка Базелака заняла 20-е место в рейтинге FBS и 12-е место среди вернувшихся из этой группы. Нападение Миссури, дающее ему больше возможностей бросить мяч на поле, и его способность лучше контролировать ситуацию в сложных ситуациях — вот то, на что стоит обратить внимание этой осенью.

16. ШТАТ ФЛОРИДА: МАККЕНЗИ МИЛТОН,

.

Милтону сложно присвоить звание из-за его тяжелых травм. В последний раз он играл на 13-й неделе сезона 2018 года, прежде чем получил ужасную травму ноги, которая потребовала реконструктивной хирургии и чуть не закончилась ампутацией. Если он вернется в качестве того же игрока в 2017 и 2018 годах, то он легко войдет в разговор как квотербек из топ-15 FBS.

Проходной балл Милтона 90,1 за последние два сезона на поле считается третьим лучшим результатом в стране.Он был одним из лучших нападающих в колледже по футболу, заняв пятое место в рейтинге лучших результативных бросков за эти две кампании. Он также был одним из лучших, когда дело касалось карманного присутствия и создания чего-то из ничего под принуждением. Милтон преобразовал давление в мешки с низким показателем FBS — 8,1% (средний показатель более чем вдвое больше), занял первое место по проходным приземлениям под давлением (16) и в среднем набирал семь ярдов за схватку.

17. ШТАТ ИОВА: БРОК ПУРДИ,

Профиль оценок

Purdy действительно уникален.Он выглядел следующим подающим надежды звездным квотербеком как настоящий первокурсник в 2018 году, когда он закончил с проходным баллом 88,0, но в следующие несколько сезонов предпринял шаги назад. Его проходной балл упал до 82,2 в 2019 году, а затем до 74,2 в 2020 году.

Его сильные и слабые стороны в каждом из этих трех сезонов оставались неизменными: он играл хорошо в ритме, но слишком часто пытался форсировать ситуацию, когда находился под давлением. Несмотря на эту хорошую, не лучшую, проходную оценку в прошлом сезоне, Парди занял четвертое место в FBS по отрицательно оцененной скорости броска в ритме — после Зака ​​Уилсона, Мак Джонса и Джастина Филдса.В то же время, однако, он занимал восьмое место по скорости игры, достойной текучести, когда находился под давлением. Менталитет геймера — это плюс, но Парди должен знать свои пределы в 2021 году.

18. ВИРДЖИНИЯ: БРЕННАН АРМСТРОНГ

Армстронг не самый красивый квотербек с точки зрения механики и не обладает высокой точностью, но он заставил его работать в воздухе, нанеся много повреждений ногами в 2020 году. Он набрал проходной балл 85,2 и 78,8 стремительный уклон на пути к 90-м.3 балла за год, который был его первым годом в качестве стартера.

Он также совершил несколько впечатляющих бросков под давлением. Армстронг уступает только Спенсеру Раттлеру из Оклахомы по самому высокому показателю бросков, когда он находился под принуждением в стране в прошлом сезоне.

19. СВОБОДА: МАЛИК УИЛЛИС

Уиллис возлагает заоблачные надежды на то, что он станет квотербеком не в Power Five, после того, что он показал в первом году с Liberty в 2020 году. Он наэлектризован на земле и сочетает это с пушкой на руке.Нащупывание было проблемой, но он действительно набирал 10 или более ярдов в 32,8% своих пробежек и отбивал 0,34 отборов за попытку, что занимало второе и пятое место соответственно среди всех квотербеков FBS за один сезон в эпоху PFF College.

Как распасовщик, он набрал 7,1% результативных бросков, став 16-м в рейтинге FBS. Инструменты предназначены для того, чтобы он был значительно выше в этом списке. Ему просто нужно еженедельно демонстрировать постоянство в качестве распасовщика и в конечном итоге повысить проходной балл 75,5, который он поставил в 2020 году.

20. ШТАТ ОГАЙО: C.J. STROUD

Страуд имеет широкий спектр результатов, учитывая, что он еще не сделал отступления на уровне колледжа. Тем не менее, у него будет хорошая ситуация, и он, похоже, обладает чертами, которые позволят добиться огромного успеха в качестве стартового квотербека Баккейса.

Журнал PFF’s College Football Preview Magazine 2021 предлагает уникальное глубокое погружение в каждую команду и каждую конференцию в FBS. Вы получите оценки PFF, разбивку по позициям, прогнозы ставок, данные о точности и многое другое, что сделает его единственным ресурсом, который вам понадобится для подготовки к сезону студенческого футбола 2021 года.

По данным 247Sports, новобранец из топ-50 2020 года и занимающий 2 место в своем классе профессиональный квотербек пойдут по стопам Джастина Филдса, который был самым ценным игроком в студенческом футболе в сезонах 2019 и 2020 годов. Это сложная задача, но, опять же, инструменты есть. Доказано, что у него большая рука и он может представлять угрозу на земле, как он показал на своем одиночном керри в 2020 году, результатом которого стало приземление на 48 ярдов.

21. WAKE FOREST: СЭМ ХАРТМАН

Хартман вернулся на стартовую работу в 2020 году после того, как травма сорвала его кампанию 2019 года, и он начал сезон в абсолютном разрыве.В своих первых семи играх Хартман показал проходной балл 87,4. Его игра упала в последних двух играх Demon Deacons после месяца отсутствия на поле, но он все же доказал, каким распасовщиком он может быть.

Хартман занял 14-е место по скорости броска в студенческом футболе и показал хорошие результаты в чистом кармане, получив оценку 90,9 за такие отбросы. Очищение его принятия решений под давлением и снижение паники в этих играх — вот области, в которых он может улучшить эту осень.

22. АЛАБАМА: БРАЙС ЯНГ

Это было бы аномалией ситуации, если бы наступательные показатели Алабамы не снизились в 2021 году. Единственный вопрос: в какой степени? Брайс Янг — 2-е место в общем рейтинге 2020 года по версии 247Sports — заменит Мака Джонса, который получил самую высокую оценку за один сезон в эпоху PFF College в 2020 году и привел Алабаму к самым успешным. пройти показатель игры любой команды за последние семь лет.

Янг увидел поле в зачистке, как настоящий первокурсник, и результаты были неоднозначными.Он взял семь мешков и сделал три достойных по обороту розыгрыша на 31 дропбэке. Его принятие решений было временами шатким, но не стоит слишком вдаваться в эту небольшую выборку. В конце концов, этого ожидают от настоящего первокурсника. Он прошел через свои успехи и показал хорошую руку, а также продемонстрировал впечатляющую способность расширять игру и делать броски, когда его сбивают с ритма.

23. ГРУЗИЯ: JT DANIELS

Шумиху вокруг JT Daniels Heisman, возможно, нужно немного смягчить. Да, он в прошлом пятизвездочный новобранец и показал одно из лучших выступлений в сезоне 2020 года в своем дебюте в роли Джорджии Бульдога, но его результаты в трех других матчах в дополнение к его прошлой игре вызывают беспокойство.

Как истинный первокурсник USC в 2018 году, Дэниэлс занял 118-е место в рейтинге PFF, 127-е место по показателю количества игр, достойных текучести, и 129-е место в рейтинге PFF по количеству побед выше среднего. Он выглядел как тот же игрок в открытии 2019 года до того, как разорвал свою крестообразную связку. Затем Дэниелс перебрался в Джорджию и не выходил на поле до 12-й недели 2020 года из-за процесса реабилитации и других игроков, опережающих его на диаграмме глубины, но он выглядел заметно лучше.

В ту ночь против штата Миссисипи он заработал 95 баллов.0 Оценка ПФФ и совершила шесть больших бросков. Тем не менее, Дэниелс заработал всего 68,5 проходных баллов в трех других своих матчах, включая четыре достойных оборота игры против Цинциннати в Peach Bowl.

Дэниэлс действительно выглядел более отполированным квотербеком в 2020 году по сравнению с его временами в USC, но любые разговоры о Хейсмане или пятерке лучших квотербеков все еще преждевременны. Хотя он выглядел более комфортно, его карманное присутствие было все еще далеко от идеала, он подвергал мяч опасности, и его точность снижалась, несмотря на высокий процент выполнения.

Пока Дэниэлс не покажет, что он может приблизиться к воспроизведению своего выступления против штата Миссисипи, он не участвует в разговоре с квотербеком высшего уровня.

УРОВЕНЬ 3: ХОРОШО, НЕ ВЕЛИКОЕ

Прохожие на Уровне 3 бывают разных форм и имеют широкий диапазон потолков. Некоторые из них более неопытны, но могут перейти на уровень 2, в то время как другие в большей степени зависят от схемы или ограничены в некоторой степени, но совершили свои соответствующие нарушения на качественном уровне.

24. ЗАПАДНЫЙ МИЧИГАН: КАЛЕБ ЭЛЕБИ

Элеби прошел путь от борьбы за первокурсник в 2018 году с проходным баллом 59,9 за пять матчей до того, что в 2019 году он не проиграл даун. Затем он поставил элитный проходной балл 91,5 за шесть стартов в прошлом году. В сезоне, сокращенном из-за коронавируса, он привел к тому, что Западный Мичиган заработал 0,48 очка за проход. Это дало команде третье место по результативности передач в стране.

В то время как это была половина обычного количества игр в регулярном сезоне, Элеби опубликовал 70.Оценка PFF для одиночной игры 0+ в каждом конкурсе. Это многообещающий знак, поскольку он пытается поддерживать этот успех в течение всего года в 2021 году. Похоже, что он может стать следующим квотербеком «пятерки» этой осенью после того, как в прошлом году проявил свой талант и умение принимать решения.

25. ХЬЮСТОН: КЛЕЙТОН ТЮН

У

Tune есть возможность финишировать в числе пяти лучших распасовщиков Группы пяти этой осенью. У него заканчивается год, когда он вошел в топ-20 квотербеков FBS в проходной оценке с чистым карманом.В целом, он выставил 84,7 балла по PFF и возглавил AAC по результативности бросков (6%). Самое главное, он был последовательным. Только в одном из его восьми стартов он не набрал проходной балл 70.0 в одиночной игре.

26. Висконсин: Грэхэм Мерц

Если кто-то поднимается на уровень выше из этой группы, то это, вероятно, Грэм Мертц. Однако в то же время у него есть все шансы немного поскользнуться. Мерц присоединился к Висконсину в 2019 году в качестве новобранца, занявшего 65-е место в классе 2019 года, согласно 247Sports, и имел один из лучших стартовых дебютов в эпоху PFF College.В прошлом году в матче с Иллинойсом он не бросил ни одного неуловимого мяча и бросил три важных броска на пути к проходному баллу 93,9.

По сообщениям, Мерц получил травму плеча в следующей игре Висконсина против Мичигана, но отыграл ее. Это частично объясняет, почему за последние пять игр он получил плохую проходную оценку 53,4, что далеко от распасовщика, который мы видели в начале года. Только время покажет, насколько сильно на него повлияла эта травма, но он показал, что у него такой же высокий потолок, как и у всех за пределами двух верхних уровней.

27. ЗАПАДНАЯ ВИРДЖИНИЯ: JARRET DOEGE

Доэдж максимально использовал шаткий состав второго плана в Западной Вирджинии, набрав проходной балл 78,9 с момента его прибытия в 2019 году. Он занимает второе место после Чикаго Беар Джастина Филдса в EPA, созданного сверх ожиданий с 2014 года, команды и соперника. скорректированная метрика.

Но нельзя сказать, что у него нет недостатков. В то время как Доге является высококачественным распасовщиком на коротких и промежуточных уровнях поля, его точность передачи мяча в глубину бледнеет по сравнению с ним.Тем не менее, его игра в ритме помогает это уравновесить. Его проходной балл по таким играм является одним из пяти наивысших оценок среди вернувшихся квотербеков Power Five.

28. ВАШИНГТОН: ДИЛАН МОРРИС,

Моррис — довольно ограниченный распасовщик и мало что даст в игре с глубокими пасами, но он очень бережно относится к мячу в других местах и ​​не допускает много ошибок.

За четыре старта в 2020 году он получил проходной балл 81,9, показал минимальный коэффициент оборачиваемости 1,6% и вывел хаски на четвертое место по эффективности пасов в Pac-12.Он был автоматом из чистого кармана и при этом не пытался ничего особенного сделать в поле. Большинство команд хотели бы иметь такую ​​надежную передачу.

29. ТЕННЕССИ: HENDON HOOKER

Состав

Теннесси был распотрошен через трансферный портал, но у него есть некоторый потенциал благодаря комбинации нового главного тренера Джоша Хьюпеля и Хендона Хукера, трансфера из Virginia Tech. Квотербек с двойной угрозой пользовался большим успехом с Hokies, чему способствовали передачи игрового действия и его влияние в стремительной игре.

Квотербек из Теннесси Хендон Хукер (5) делает пас, когда полузащитник нападения из Теннесси Кейд Мэйс (68) защищает на весеннем матче Orange & White на стадионе Neyland в Ноксвилле, штат Теннеси, в субботу, 24 апреля 2021 г. Фото: Calvin Mattheis / News Sentinel

Проходной балл Хукера по дропбэкам игрового действия был почти на 30 баллов выше, чем по прямым дропбэкам (85,9 против 57,0) в 2020 году, а его разница в процентном соотношении опередила всех квотербэков FBS (+ 13,5%). Хойпель возглавил нападение UCF, которое привело к увеличению количества игровых действий в топ-10 в 2020 году (45%), при этом многие из полученных пасов были нацелены на проходы по боковой линии.Хукер не будет так часто попадать в эти девять маршрутов, как последний квотербек Хёупель Диллон Гэбриел, но это не значит, что он все еще не может быть хорошим квотербеком для «Волонтеров».

30. БОСТОНСКИЙ КОЛЛЕДЖ: ФИЛ ЮРКОВЕЦ

Юрковец был одним из самых ярких квотербеков Power Five в 2020 году благодаря своим умениям играть под давлением. Его 13 результативных бросков под давлением заняли третье место в рейтинге FBS. Наряду с этим, мобильный прохожий ростом 6 футов 5 226 фунтов произвел 77.0 проходной балл при создании вне структуры, пятерка лучших в FBS.

Но Юрковец испытывал трудности в структуре, так как его проходной балл за эти откаты был почти на 15 баллов ниже. У него также было девятое место по рейтингу отрицательно оцененных бросков в FBS при игре в ритме. У Юрковца есть инструменты, но он слишком беспечен, что мешает ему достичь потолка.

31. ШТАТ ВАШИНГТОН: ДЖЕЙДЕН ДЕ ЛОРА,

Джейден де Лаура, возможно, даже не станет стартовым игроком «Пумы», но он, несомненно, лучший распасовщик в составе, несмотря на то, что в прошлом году он сыграл всего четыре игры в течение своего сокращенного из-за коронавируса сезона новичков.Он показал проходной балл 78,4 и был точен, своевременно отдавая мяч. По передачам, брошенным за 2,5 секунды или меньше от снапа, де Лаура занял четвертое место в рейтинге FBS по проходному баллу (91,0). Его производительность ухудшалась, когда он держал мяч внутри лузы, так что это то, что нужно контролировать, двигаясь вперед. Тем не менее, де Лаура — многообещающий талант защитника.

32. НОТР-ДАМ: ДЖЕК КОАН

Коан станет стартовым квотербеком Fighting Irish после того, как он был стартовым игроком из Висконсина, когда последний был здоров в 2019 году.В том году Коан получил приличную проходную оценку 77.0, но сделал больше достойных оборота розыгрышей, чем крупных бросков. Это идеально отражает его тип распасовщика: он может играть структурированно и точен под ним, но не будет вести захватывающий, взрывной пас. Показатель выдающихся бросков Коана в 2019 году занял 89-е место в FBS, и он показал достойный по обороту показатель бросков при бросках более 20 ярдов, которые заняли предпоследнее место.

33. СЕВЕРНЫЙ ТЕХАС: ОСТИН АУН,

Значительная часть неудач Ауне в прошлом сезоне приходилась на игровые концепции, и большинство из них заканчивались ударами с поля.Он занял третье место в рейтинге FBS (58,8%), а его средняя глубина попадания в цель при таких бросках составляла 16,0 ярдов вниз по полю. Он выполнил нарушение на высоком уровне, заняв шестое место в FBS по проходному баллу (92,2) и вторым по скорости бросков большого времени (14,9%) по передачам игрового действия. Это и есть путь к успеху Северного Техаса в 2021 году.

34. ЛУИЗВИЛЬ: МАЛИК КАННИНГЕМ

Каннингем — одна из самых опасных угроз на позиции квотербека.Он набрал 10 и более ярдов в 38,1% попыток в 2020 году, будь то спланированные пробежки или схватки. Это не только опередило всех защитников FBS, но и возглавило список более чем на пять процентных пунктов.

Каннингему еще есть куда расти как распасовщик. Ему нужно гораздо лучше заботиться о мяче в 2021 году, чем в прошлом сезоне, после того, как он провел несколько успешных розыгрышей в семи из 11 своих стартов. В целом за сезон он получил проходной балл 69.0 баллов.

35.ШТАТ КАНЗАС: СКИЛАР ТОМПСОН,

Томпсону немного помогает схема штата Канзас, и, как отмечается в журнале PFF College Preview Magazine за 2021 год, от него не требуется выполнять большую часть тяжелой работы. Он делает именно то, что нужно для нападения, и может на высоком уровне наносить игровые удары в нижнем поле. Приблизительно 35% откатов Томпсона с 2019 года были концепцией игрового экшена, и значительная часть из них была вертикальными. Он получил проходной балл 91,5, в то время как Wildcats довел до 0.26 EPA за проход при игре-действии за этот промежуток времени. Но по концепциям неигровых действий эти две оценки упали до 72,2 и 0,11.

36. МИННЕСОТА: ТАННЕР МОРГАН

Морган должен прийти в норму в 2021 году после получения среднего проходного балла 69,2 в 2020 году. Прошлый сезон доказал, что его кампания 2019 года, в которой он был одним из 10 лучших распасовщиков в стране (89,1), больше касалась Миннесоты. РПО-тяжелая система и нестабильность работы под давлением.

Морган не может быть квотербеком, который может нести команду на спине, но он обладает точностью и может делать упреждающие броски, необходимые для успеха на позиции.Ему все еще нужно ограничить, как часто он дает возможность защите играть с мячом.

37. МЭРИЛАНД: ТАУЛИЯ ТАГОВАЙЛОА

Лучшее описание четырех игр Таговайлоа за Терпов в 2020 году после его перехода из Алабамы оптимистично противоречиво.

Он произвел на этих прогулках оценки PFF 40,8, 90,2, 74,3 и 41,1. Таговайлоа был точным распасовщиком в ритме, расширил некоторые игры своим атлетизмом и хорошо поработал над приемными по всему полю в горизонтальных позициях, заработав 78 баллов.3 проходной балл по таким пьесам. В то же время, однако, его решения были далеко не такими, какими они должны были быть, о чем свидетельствует его достойная текучести 5,9% игровая скорость. Подобная травма мяча обычна для новичков, но такой высокий потолок — редкость. Ожидайте прорывного года от новобранца с четырьмя звездами в 2019 году.

38. БУФФАЛО: КАЙЛ ВАНТРИЗ

Ланс Лейпольд, один из 10 главных тренеров по студенческому футболу, в прошлом году руководил Вантриза, но он уехал в Канзас.Несколько опор на прочной линии наступления Буффало также ушли, и принимающая часть команды заметно слабее. В то время как Вантриз находился в благоприятной системе, которая редко просила его выигрывать игры рукой и часто создавала чистые карманы за последние два года, он показал, что он быстро и умно принимает решения, который может делать броски при очевидных пасах.

За последние два года его среднее время на выполнение передач, которые не являлись RPO, экранами или откатами для быстрой игры, является самым низким в стране.В том же периоде он получил 11-е место в рейтинге FBS за два года.

39. МЕМФИС: ГРАНТ ГАННЕЛЛ

Версия Gunnell 2020 года сильно отличалась от версии 2019 года. Он сделал 185 откатов в восьми играх за Аризону в 2019 году и продемонстрировал высокую точность на пути к проходному баллу 85,4. Но Ганнелл сделал всего 93 передачи в четырех играх в 2020 году из-за травмы в своей третьей игре в сезоне и провел семь игр, достойных ухода. Впоследствии он переехал в Мемфис после кампании 2020 года.Он специально присоединился к «Тиграм», чтобы отправить мяч вниз, поскольку это не то, на что ему дали зеленый свет в «Аризоне».

В карьере Ганнелла средняя глубина цели одна из самых низких в студенческом футболе — всего 6,1 ярда. Тем не менее, он преуспевает в таких бросках, обеспечивая точность пасов 65,5% при 10-ти ярдовых попытках и получая проходную оценку 93,2. Несмотря на то, что у него не было достаточно снимков, чтобы пройти квалификацию, его точная передача была лучшей в стране. Он главный кандидат на продвижение вверх по этому списку.

40. CINCINNATI: DESMOND RIDDER

Этот рейтинг может стать неожиданностью для некоторых, но Риддер просто не показал достаточного количества распасовщиков. Он может много играть ногами, о чем свидетельствует его 61 пробежка на 10 с лишним ярдов за последние два сезона — второй результат среди квотербеков FBS.

Риддер имеет проходной балл всего 67,7 с 2019 года, и он, как известно, изо всех сил пытается наносить удары с поля. Его скорректированный коэффициент выполнения 33,3% бросков на 20 с лишним ярдов в 2020 году занял 11-е место в рейтинге FBS.Он сделал всего 14 глубоких передач за год, и Цинциннати занял шестое место в AAC и 60-е место в FBS по скорости передачи пасов более 15 ярдов (14,9%).

Он ловкий, но бездоказательный распасовщик. Если Цинциннати собирается побороться за стол и украсть пару выездных побед на раннем этапе против жестких команд Нотр-Дама и Индианы, это должно измениться.

41. СОСТОЯНИЕ ФРЕСНО: ДЖЕЙК ХЕНЕР

Хенер, ранее игравший в Вашингтоне, дебютировал в штате Фресно в 2020-х годах. Он получил три оценки PFF по одиночной игре к северу от 80.0, но его три других выхода не достигли 60,0 балла. В конце концов, он показал высокий потолок для квотербека Группы пяти, о чем свидетельствует его высокий процент бросков в 8,3%, который занял восьмое место в рейтинге FBS. Несомненно, есть повод для оптимизма в его приближении к падению.

42. ТЕХАС: КЕЙСИ ТОМПСОН

Этой осенью начнется новая эра техасского футбола, поскольку команда приветствует бывшего координатора атак из Алабамы Стива Саркисяна в качестве своего главного тренера и Кейси Томпсона в качестве вероятного стартового квотербека.Томпсон за свою карьеру в Техасе сделал всего 34 отказа, но подал многообещающие признаки.

Журнал PFF’s College Football Preview Magazine 2021 предлагает уникальное глубокое погружение в каждую команду и каждую конференцию в FBS. Вы получите оценки PFF, разбивку по позициям, прогнозы ставок, данные о точности и многое другое, что сделает его единственным ресурсом, который вам понадобится для подготовки к сезону студенческого футбола 2021 года.

В 2020 году он сделал 17 передач и получил проходную оценку 90.0, закрепив за собой три важных броска.Томпсон показал фантастическое расположение мяча и тайминг, при этом оставаясь спокойным и совершив пару важных бросков под давлением. Он станет прорывным кандидатом в 2021 году.

43. СОСТОЯНИЕ САН-ХОЗА: НИК СТАРКЕЛ

Играя в своей третьей программе за три года, Старкель провел лучший сезон в своей карьере со «Спартанцами». Независимо от того, руководил ли он быстрой игрой в штате Сан-Хосе или действовал в настоящей игре с отбрасыванием пасов, Старкель финишировал с девятым лучшим проходным баллом среди квотербеков, не принадлежащих к Power Five (78.7), в то время как спартанцы занимают 16-е место по рейтингу успешных передач в FBS.

44. ШТАТ СЕВЕРНАЯ КАРОЛИНА: ДЕВИН ЛИРИ

Лири выглядел как новый распасовщик, пока не получил травму в 2020 году. В четырех играх он получил проходную оценку 79,2, что на 22 очка лучше, чем его оценка в 2019 году. Он сделал как минимум четыре важных броска в каждом из трех своих стартов. Лири также сделал несколько хороших бросков за боковую линию и получил глубокую проходную оценку, которая должна была войти в десятку лучших в студенческом футболе.

Единственный вопрос: может ли он перебросить середину поля на промежуточном уровне? Он сделал пару хороших бросков, чтобы провести своих приемников через поле в этом диапазоне, но ему нужно будет поддерживать этот успех в течение целого года в 2021 году.

45. СОСТОЯНИЕ БУАЗА: ХЭНК БАХМЕЙЕР / ДЖЕК САРС

Многие футбольные программы колледжей хотели бы иметь ситуацию с защитником штата Бойсе. В состав Broncos входят два качественных квотербека — Хэнк Бахмайер и Джек Сирс, оба из которых участвовали в игре в 2020 году из-за травм.

Бахмайер заработал 76,3 балла по рейтингу PFF за пять стартов, что стало вторым самым низким показателем текучести игроков в стране (1,1%). Сирс, новобранец с четырьмя звездами, перешедший из Университета Южной Калифорнии в 2020 году, заработал 93,3 балла по рейтингу PFF в 33 неудачных матчах в трех играх и продемонстрировал довольно глубокий мяч с четырьмя отличными бросками. Он выступил аналогичным образом в USC за один старт, получив проходной балл 88,2.

Нападение под руководством Sears генерировало 0,78 EPA за проход, а Бахмайер — 0,13. Воспринимайте это с недоверием, поскольку у Сирса было гораздо меньше представителей, но это еще один пример его возможного преимущества.Несмотря на то, что ему не хватает опыта, он совершил несколько массивных бросков вниз по полю и провел взрывное нападение. Бахмайер, с другой стороны, просто неизменно тверд.

Независимо от того, кто выиграет стартовую позицию, нападение штата Бойсе будет в отличной форме.

46. SMU: TANNER MORDECAI

SMU будет интересной командой для мониторинга этой осенью, поскольку она приветствует в Оклахоме трансфер Таннера Мордекая. Четырехзвездочный новобранец 2018 года сделал 70 передач за три года в Оклахоме и ушел с 79.0 проходной балл. Он был точен и показал, что для точного попадания мяча ему не нужно настраивать ноги. Мардохей, безусловно, продемонстрировал качества, необходимые для успеха в нападении на СМУ.

47. ЛУИЗИАНА: ЛЕВИ ЛЬЮИС

Льюис может быть маленьким, но он все еще может выполнять работу в воздухе и на земле. В 2020 году он получил 79,0 балла PFF, заняв 26-е место из 92 квалифицированных квотербеков FBS. Иногда он слишком долго держит мяч, но он отлично избегает мешков. Льюис занял пятое место в рейтинге FBS по проценту вынужденных отказов, преобразованных в мешки в 2020 году (10%).За последние два сезона он привел Ragin ‘Cajuns к 22-м наиболее эффективным атакам в пасах и, наряду с их элитной защитой и бегущим назад Крисом Смитом, сыграет ключевую роль в этой команде, борющейся за корону Солнечного Пояса вместе с Прибрежной Каролиной. .

48. ЗАПАДНЫЙ КЕНТУКИ: БЕЙЛИ ЗАППЕ,

«Хиллтопперс» сделали крупный трансфер в Заппе, который присоединился к команде из «Хьюстон Баптист». В то время как его команда «Хаски» сыграла в четырех матчах прошлой осенью 1: 3, Заппе показал себя превосходно, заработав 86 баллов.1 проходной балл и приводит команду к 0,38 EPA за проходную игру.

Zappe получил элитный проходной балл 91,2 и обеспечил минимальный уровень оборачиваемости 1,7% против конкурентов FBS во время пребывания в Houston Baptist. Он должен послужить искрой для обгона Хиллтоппера, занявшего предпоследнее место в рейтинге C-США по проходному баллу и предпоследнее место по эффективности прохода.

49. BYU: JAREN HALL

Холл намерен взять на себя невыполнимую задачу — заменить легенду BYU Зака ​​Уилсона, который в 2020 году заработал наивысшую оценку PFF за один сезон, когда-либо полученную квотербеком не из Power Five.

Тампа, Флорида, США; Защитник Бригама Янга Кугарз Джарен Холл (3) разминается перед игрой между Южно-Флоридскими Буллз и Бригамом Янгом Кугарз на стадионе Раймонда Джеймса. Предоставлено: Douglas DeFelice-USA TODAY Sports

Hall в последний раз участвовал в игре в 2019 году. Он продемонстрировал выносливость, атлетизм, силу рук и способность играть в движении, в конечном итоге получив оценку 77,3 PFF в 55 играх.

Хотя Холлу вряд ли удастся повторить уровень производства Уилсона, у него определенно есть талант войти в число лучших квотербеков страны, не принадлежащих к Power Five, и сдержать изнурительный регресс, который будет угрожать этой программе BYU.Его самым большим препятствием будет оставаться здоровым, с чем он боролся в прошлом.

50. ВОСТОЧНЫЙ МИЧИГАН: ПРЕСТОН ХАТЧИНСОН

Хатчинсон преуспел на небольшой выборке в 2019 году и сделал то же самое, что и в стартовом составе на полную ставку в 2020 году. Он закончил год с оценкой 81,8 PFF, которая заняла 20-е место в рейтинге FBS и привела Восточный Мичиган к наиболее успешному проходящему преступлению PFF. Колледж эпохи. Его восемь результативных бросков по мишеням с дистанции 10-19 ярдов заняли третье место в рейтинге FBS в прошлом сезоне.Eagles могут удивить некоторые команды MAC, если Хатчинсон продемонстрирует дальнейший рост в 2021 году.

51. МАРШАЛЛ: ГРАНТ УЭЛЛЗ

Уэллс пережил период взлетов и падений в дебютном сезоне в качестве стартового квотербека Thundering Herd в 2020 году. За свои первые семь выходов он получил проходную оценку 87,2. Но в последних трех соревнованиях он набрал 42,8 балла. Принятие решений и последовательность, которые являются общими проблемами для такого молодого прохожего, как Уэллс, — это две области, в которых Маршалл должен увидеть рост в 2021 году.

Тем не менее, Уэллс был одним из 10 самых успешных распасовщиков в стране в прошлом году по реальным откатам без игровых действий. Он — главный кандидат на то, чтобы взлететь в этом списке в 2021 году.

УРОВЕНЬ 4: СРЕДНЕЕ

Эти квотербэки колледжа занимают одно из первых мест среди своих сверстников. Некоторые из них едва продемонстрировали способность производить продукцию на уровне качества и неизменно являются средними. А есть другие, которые показали звездную игру, но затем свели на нет ее плохой игрой.Игрокам этого уровня нужны элитные вспомогательные броски с обеих сторон мяча, если их командам предстоит долгая жизнь.

52. ПИТТСБУРГ: КЕННИ ПИКЕТТ
53. ТУЛАН: МАЙКЛ ПРАТТ
54. UAB: ТАЙЛЕР ДЖОНСТОН III
55. TCU: МАКС ДАГЕРТГАН
56. 57. СРЕДНИЙ ТЕННЕССИ: БЕЙЛИ ХОКМАН
58. ТОЛЕДО: КАРТЕР БРЭДЛИ
59. КАЛ: ЧЕЙЗ ГАРБЕРС
60.PURDUE: JACK PLUMMER / AIDAN O’CONNELL
61. VIRGINIA TECH: BRAXTON BURMEISTER
62. ГОСУДАРСТВО МИЧИГАН: PAYTON THORNE / ANTHONY RUSSO
63. CHARLOTTEN BONNER
65. OKLAHOMA STATE: SPENCER SANDERS
66. ECU: HOLTON AHLERS
67. AUBURN: BO NIX
68. OHIO: KURTIS ROURKE

70.МИЧИГАН: КАДЕ МАКНАМАРА / АЛАН БАУМАН
71. ЮТА: ЧАРЛИ БРЕВЕР
72. ШТАТ АРИЗОНА: ДЖЕЙДЕН ДЭНИЕЛС
73. UNLV: ДЖАСТИН РОДЖЕРС
СТРАНА: ДЖАСТИН РОДЖЕРС
. 75. НЕБРАСКА: АДРИАН МАРТИНЕС
76. СОСТОЯНИЕ ГРУЗИИ: CORNELIOUS BROWN IV
77. СОСТОЯНИЕ ШАРА: DREW PLITT
78. UTSA: FRANK HARRIS

УРОВЕНЬ 5: НЕОБХОДИМО УЛУЧШИТЬ / БОЛЬШЕ РЕПС

Квотербэки из этой группы, скорее всего, не будут руководить взрывными преступлениями в 2021 году.Есть некоторая долгосрочная надежда на команды со свежими новичками, такими как Арканзас, Техас A&M, Стэнфорд и, возможно, Орегон, но краткосрочная уверенность остается низкой для таких ситуаций квотербека. Как и в предыдущем уровне, они не будут нести ответственность за огромный успех своих команд без помощи элитных вспомогательных бросков с обеих сторон мяча.

79. OREGON: ANTHONY BROWN / TY THOMPSON
80. TULSA: DAVIS BRIN
81. FAU: NICK TRONTI
82.НОВАЯ МЕКСИКА: TEVAKA TUIOTI / TERRY WILSON
83. MISSISSIPPI STATE: WILL ROGERS / JACK ABRAHAM
84. UTEP: GAVIN HARDISON
85. RICE

0 MISSISSIPPI: ARFFOVONI JOHNCCA 86. RICE

0 MISSISSIPPI. ДЖЕФФЕРСОН
87. Калифорнийский университет в Лос-Анджелесе: Дориан ТОМПСОН-РОБИНСОН
88. ПЕНСКИЙ ШТАТ: ШОН КЛИФФОРД
89. ТРОЙ: ГУННАР УОТСОН / ТЭЙЛОР ПАУЭЛЛ
90. БРЭНДТОРАДО 91:
90. .НОВОЕ МЕКСИКА: УЕСТОН ЭГЕТ / ДЖОНА ДЖОНСОН
92. ВИОМИНГ: ШОН ЧЕМБЕРС
93. ГАВАИ: ШЕВАН КОРДЕЙРО
94. РАТГЕРС: НОА ВЕДРАЛ
. ИЛЛИНОАС: БРЭНДОН ПИТЕРС
97. КЕНТУКИ: УИЛЛ ЛЕВИС
98. ТЕХАС A&M: Зак КАЛЬЗАДА / ХЕЙНС КИНГ
99. СТЭНФОРД: ТАННЕР МАККИ / ДЖЕК СИМЗ 6 ТЕХАС 9005 101.СЕВЕРНЫЙ ИЛЛИНОИС: ДАСТИН ФЛЕТЧЕР / РОКИ ЛОМБАРДИ
102. VANDERBILT: KEN SEALS

УРОВЕНЬ 6: НЕОБХОДИМО ЗНАЧИТЕЛЬНОЕ УЛУЧШЕНИЕ

Эти ситуации квотербека омрачены прошлой плохой игрой или бесперспективными кандидатами на лидерство в нападении в 2021 году.

103. CMU: ДЭНИЕЛ РИЧАРДСОН
104. ЮЖНАЯ МИСС: ТРЕЙ ЛОУ III
105. ЛУИЗИАНА ТЕХ: ААРОН АЛЛЕН / ЛЮК ЭНТОНИ
1060003 БАЙЛОРАН 106.ЮЖНАЯ АЛАБАМА: ДЖЕЙК БЕНТЛИ
108. КАНЗАС: ДЖЕЙСОН БИН / ДЖАЛОН ДЭНИЕЛС / МАЙЛЗ КЕНДРИК
109. ВВС: HAAZIQ DANIELS
9000 11110. COLORADO ARDENT
9000 11110. COLORADO ARORD 9000 COLORADO

03: TODDA GUNNER CRUZ / WILL PLUMMER

112. IOWA: SPENCER PETRAS
113. СОСТОЯНИЕ ПРИЛОЖЕНИЯ: CHASE BRICE
114. ГРУЗИЯ ЮЖНАЯ: ДЖУСТИН ТОМЛИН
115. АРМИЯ: 1164 115. АРМИЯ: 1164 ТИРИСТИЯ .СЕВЕРО-ЗАПАД: РАЙАН ХИЛИНСКИ
117. ШТАТ ТЕХАС: БРЭДИ МАКБРИД / ТАЙЛЕР ВИТТ
118. ШТАТ САН-ДИЕГО: ДЖОРДОН БРУКШИР / ЛУКАСОН / ДЖАЛЕН МЭЙДЕН
-ДЖАЛЕН МЭЙДЕН
-ДЖАЛЕН МАЙДЕН
-ДЖАЛЕН МЭЙДЕН
120. ХРАМ: Д’ВАН МАТИС
121. БОУЛИНГ ЗЕЛЕНЫЙ: МЭТТ МАКДОНАЛЬД
122. АКРОН: Зак ГИБСОН / КАТО НЕЛЬСОН
123. USF: КАДИ ФОРТИН / КАТРАВИСЕН / KATRAVISENSH 124 / KATRAVISENSH 124 Герцог: ГУННАР ХОЛЬМБЕРГ
125.ЮЖНАЯ КАРОЛИНА: ЛЮК ДОТИ
126. Флот: Ксавьер Арлайн
127. СТАРЫЕ ДОМИНИОНЫ: ХАЙДЕН ВОЛЬФ
128. FIU: МАКС БОРТЕНШЛАГЕР 900ISACK 129. КОННЕКТИКУТ 900ISACK 129. КОННЕКТИКУТ . DZURO / ZAMAR WISE / TYLER LYTLE

Совет

DI вводит изменение численности футбольного персонала

Численность персонала в программах подразделения Football Bowl может иметь новые параметры, если будет принято законодательство, внесенное в цикл 2017-18 гг. Советом Дивизиона I.

Предложение требует, чтобы школы назначили 30 человек, которые будут участвовать в мероприятиях по набору футбольных команд на территории кампуса в FBS. В случае принятия предложение вступит в силу 1 августа 2018 г.

Эти люди смогут инициировать письменную и электронную переписку с потенциальными студентами-спортсменами, их родителями или законными опекунами.

Число назначенных лиц будет включать всех учитываемых тренеров, которые в настоящее время являются главным тренером и девятью помощниками, но увеличится до 10 помощников. Январь.9. Он также будет включать всех выпускников-помощников тренеров. Школы FBS допускаются максимум к четырем ассистентам-выпускникам по футболу.

Каждая школа должна будет объявить об этом перед своей первой предсезонной практикой. Директора по легкой атлетике должны будут просмотреть письменные материалы и отправить подписанную копию в офис конференции школы.

БОЛЬШЕ: Совет DI принимает новую модель набора персонала

Школы могут вносить изменения в обозначения только из-за выбытия, и любое изменение требует одобрения директора по легкой атлетике.

Согласно предложению, все назначенные должны будут сдавать экзамен по набору персонала NCAA каждый год, прежде чем приступить к какой-либо деятельности по набору персонала.

Комитет по надзору за футболом Дивизиона I будет собирать отзывы от главных тренеров, спортивных директоров, администраторов по соблюдению требований, офисов конференций и других групп в течение законодательного цикла 2017–18 годов. Комитет планирует рассмотреть этот отзыв на своем следующем личном заседании в январе.

«Мы чувствуем, что ужесточили правила, которые уже записаны», — сказал Боб Боулсби, председатель Комитета по надзору за футболом и комиссар конференции «Большой 12».«Главный тренер, у которого скоро будет 10 помощников, и четыре ассистента — это люди, которые должны тренировать студентов-спортсменов, готовить их к игре и заниматься набором кадров».

Предсезонная практика

Совет также представил закон, который установит новую дату начала предсезонной футбольной практики.

В случае принятия, команды могут рассчитывать время начала тренировок, отсчитывая 25 дней с их первой игры в сезоне. Эти 25 дней не включают запланированный выходной один раз в неделю.

Например, команда, играющая в свою первую игру 1 сентября 2018 г., может провести свою первую тренировку 3 августа.

Отзывы Ассоциации тренеров американского футбола повлияли на решение комитета по надзору предложить 25 тренировок в качестве правильного количества тренировок для подготовки к сезону.

«Мы также говорили о 14-недельном стандартизированном сезоне, но стало очевидно, что это будет препятствием в наших усилиях по сохранению всех практик в августе», — сказал Боулсби.«Мы не хотели, чтобы практики проходили в июле и противоречили окончанию летней школы».

Не раньше января Совет сможет проголосовать по двум футбольным предложениям.

Сумма для начала торговли

Если вы хотите стать трейдером Forex и хотите знать, сколько денег вам следует потратить на торговлю, вы попали в нужное место. В этой статье мы объясним, какая минимальная сумма денег вам потребуется для торговли валютами.

Для начала помните, что существуют демо-счета, которые позволяют вам практиковаться в торговле, не вкладывая ни единого доллара. Размер демо-счета в FBS может достигать 1 миллиона долларов. Демо-счет позволит вам попрактиковаться в открытии ордеров и настройке размеров позиций.

Если вы готовы торговать с использованием реального счета и зарабатывать реальные деньги, вы должны знать, что сумма денег, необходимая для начала торговли, зависит от выбранного вами типа счета.

Например, , чтобы торговать на микро-счете, вам необходимо внести минимум 5 долларов.Вы сможете открывать ордера объемом от 0,01 лота и использовать приличное кредитное плечо. Если вы планируете открывать много сделок, рассмотрите стандартный счет с плавающим спредом в 0,5 пункта. Для этого типа учетной записи требуются минимальные вложения в размере 100 долларов США. Обратите внимание, что вы можете открыть по одной учетной записи каждого типа. Чтобы иметь возможность открыть до 10 учетных записей любого типа, вам необходимо подтвердить свой личный кабинет, изменить метод подтверждения с электронной почты на SMS и убедиться, что общий депозит для всех учетных записей в вашем личном кабинете составляет 100 долларов США или более.

Размер вашей сделки определяется размером депозита

Минимальный размер сделки с FBS составляет 0,01 лота. Лот — стандартный размер контракта на валютном рынке. Это равно 100 000 единиц базовой валюты, таким образом, 0,01 лота составляет 1000 единиц базовой валюты. Если вы покупаете 0,01 лота по EUR / USD и ваше кредитное плечо составляет 1: 1000, вам понадобится 1 доллар в качестве маржи для сделки. Если вы положили 5 долларов на микро-счет, ваш депозит покроет эту маржу, и вы сможете открыть еще 4 сделки этого размера.Каждый пункт движения цены либо принесет вам, либо обойдется вам в 0,1 доллара.

Рассмотрим несколько хороших вариантов для начинающего трейдера. Приведенные здесь примеры безопасны и надежны с точки зрения управления рисками.

Депозит = 100 $

Сумма риска для одной сделки не должна превышать 5%, независимо от размера вашего депозита. Пойдем с риском 3% (3 доллара). Если вы торгуете лотом 0,01, вы можете иметь стоп-лосс до 30 пунктов — этого более чем достаточно для внутридневной позиции.Рекомендуемое соотношение риск / прибыль составляет ⅓, поэтому потенциальная прибыль по этой сделке составит 90 пунктов (9 долларов США).

Депозит = 500 $

Что делать, если ваш депозит составляет 500 долларов? При 3% -ном риске (15 долларов США) размер вашей сделки может составлять 0,15 лота. В этом случае каждый пункт прибыли / убытка будет составлять 1,5 доллара. Чем больше размер позиции, тем быстрее вы сможете зарабатывать деньги! Будет 10 пунктов для Stop Loss. Если вам нужен более широкий стоп, вы можете торговать 0,1 лотом: тогда каждый пункт будет стоить 1 доллар. Stop Loss будет 15 пунктов.При 5% -ном риске (25 долларов) вы можете позволить стоп-лосс в 25 пунктов. Прибыль в этом случае (если ваш Take Profit в 3 раза больше) составит 75 долларов.

Депозит = 1000 $

Если ваш депозит составляет 1000 долларов, вы, конечно, сможете открывать еще более крупные сделки. Риск в 3% на сделку (30 долларов) и кредитное плечо 1: 1000 позволит вам торговать 0,3 лота. Риск 10% (100 $) позволит вам торговать 1 лотом. В этом случае 30 пипсов прибыли составят прибыль в 300 долларов. Оптимальный риск в 30 долларов на сделку позволит вам торговать 0.1 лот с SL 30 пунктов. Потенциальная выгода составит 90 долларов.

Еще один важный момент: помните о Margin Calls и Stop Out. Margin Call — допустимый уровень маржи от 40% и ниже. На этом этапе компания имеет право, но не обязана закрывать все открытые позиции клиента из-за отсутствия свободной маржи. Stop Out — это минимально допустимый уровень маржи (20% и ниже), при котором торговая программа начнет закрывать открытые позиции клиента одну за другой, чтобы предотвратить дальнейшие убытки, которые приведут к отрицательному балансу (ниже 0 долларов США).

Если вы соблюдаете правила управления рисками и не вкладываете весь свой депозит в торговлю сразу, вы будете в безопасности от требований маржи и стоп-аутов.

Заключение

Как видите, для начала торговли вам нужно минимум 5 долларов. Остальное зависит от тебя! Оцените свои знания и опыт, а также подумайте о своих целях. Сколько денег вы хотели бы заработать? Как часто вы будете торговать? Чем больше депозит, чем больше размер позиции, тем больше вы заработаете с одной сделки.Все это следует взвешивать на фоне рисков.